Мембрана под фундаментную плиту: Профилированная мембрана под фундаментную плиту. Система плитного фундамента для частного дома с применением мембран planter от технониколь

Они связаны с эпителиальными клетками, мышечными клетками и шванновскими клетками, а также образуют ограничивающую мембрану вокруг центральной нервной системы. Базальная мембрана и наружная пластинка имеют сходное строение.

Базальные мембраны состоят из пяти основных компонентов: коллагена IV типа (рис. 4.11), ламинина, гепарансульфата, энтактина и фибронектина. За исключением фибронектина, они синтезируются паренхиматозными клетками. Кроме того, имеется множество второстепенных и плохо охарактеризованных белковых и ГАГ-компонентов.

Общая структура базальной мембраны хорошо охарактеризована (рис. 4.12). На это накладываются минорные белковые и углеводные компоненты, специфичные для определенных тканей. Так, например, базальная мембрана почек отличается от таковой кожи.

Основными функциями базальной мембраны являются клеточная адгезия, диффузионный барьер и регуляция роста клеток

Базальная мембрана выполняет три основные функции: механизмы адгезии, чтобы закрепить их на базальной мембране, тогда как базальная мембрана прочно прикреплена к внеклеточному матриксу опорных тканей, особенно к коллагену. Если такой интерфейс встречается в неэпителиальных тканях, например, вокруг мышечных клеток, он называется внешней пластинкой .

Во-вторых, базальная мембрана действует как молекулярное сито (барьер проницаемости), размер пор которого зависит от заряда и пространственного расположения входящего в ее состав ГАГ. Таким образом, базальная мембрана кровеносных сосудов предотвращает утечку крупных белков в ткани, мембрана почек предотвращает потерю белка из отфильтрованной крови при выработке мочи, а мембрана легких обеспечивает диффузию газов.

В-третьих, базальная мембрана, вероятно, контролирует клеточную организацию и дифференцировку путем взаимного взаимодействия рецепторов клеточной поверхности и молекул внеклеточного матрикса. Эти взаимодействия являются предметом интенсивных исследований, особенно в изучении механизмов, которые могут предотвратить распространение и пролиферацию раковых клеток по всему телу.

Фагоподобная базовая пластина секрета типа VI TssEFGK-VgrG рекрутируется в мембранный комплекс TssJLM посредством множественных контактов и служит сборочной платформой для полимеризации хвостовой трубки/оболочки

Abstract

Система секреции типа VI (T6SS) представляет собой широко распространенное оружие, предназначенное для доставки белков-токсинов в эукариотические и прокариотические клетки. 13 субъединиц T6SS образуют цитоплазматическую сократительную структуру, прикрепленную к клеточной оболочке с помощью трансмембранного комплекса. Эта структура эволюционно, структурно и функционально связана с хвостом сократительных бактериофагов. У бактериофагов хвост соединяется с белковым комплексом, называемым базовой пластинкой, которая не только служит платформой во время сборки трубки и оболочки, но и запускает сокращение оболочки. Хотя был достигнут прогресс в понимании сборки и функционирования T6SS, состав базовой пластины T6SS остается в основном неизвестным.Здесь мы сообщаем, что шесть белков T6SS — TssA, TssE, TssF, TssG, TssK и VgrG — необходимы для правильной сборки хвостовой трубки T6SS, и комплекс между VgrG, TssE, -F и -G может быть выделен. Кроме того, мы демонстрируем, что TssF и TssG имеют ограниченную гомологию последовательностей с известными компонентами фага, и мы сообщаем о сети взаимодействия между этими субъединицами и другими компонентами базовой пластинки и хвоста. В согласии с тем, что базовая пластинка является сборочной платформой для хвоста, анализы флуоресцентной микроскопии функциональных слитых белков GFP-TssF и TssK-GFP показывают, что эти белки собирают стабильные и статические кластеры, на которых полимеризуется оболочка.Наконец, мы показываем, что рекрутирование базовой пластины в аппарат требует начального позиционирования мембранного комплекса и контактов между TssG и белком TssM внутренней мембраны.

Резюме автора

В окружающей среде бактерии конкурируют за привилегированный доступ к питательным веществам или к определенной нише. Поэтому бактерии разработали механизмы для устранения конкурентов. Среди них система секреции типа VI (T6SS) представляет собой сократительную машину, функционально сравнимую с арбалетом: внутренняя трубка обернута сократительной структурой.При сокращении этой внешней оболочки внутренняя трубка продвигается к клетке-мишени и доставляет антибактериальные эффекторы. Трубчатая структура собирается на белковом комплексе, называемом базовой пластиной. Здесь мы определяем состав базовой пластины, демонстрируя, что она состоит из пяти субъединиц: TssE, TssF, TssG, TssK и VgrG. Далее мы детализируем роль белков TssF и TssG, определяя их локализацию и идентифицируя их партнеров. Мы показываем, что в дополнение к TssE и VgrG, которые, как было показано, имеют гомологию с белками gp25 и gp27-gp5 бактериофага, белки TssF и TssG также имеют гомологию с компонентами бактериофага.Наконец, мы показываем, что эта базовая пластинка рекрутируется в мембранный комплекс TssJLM перед сборкой сократительной структуры хвоста. Это исследование позволяет лучше понять ранние события пути сборки этого молекулярного оружия.

Образец цитирования: Brunet YR, Zoued A, Boyer F, Douzi B, Cascales E (2015) Фагоподобная базовая пластина секрета типа VI TssEFGK-VgrG рекрутируется в мембранный комплекс TssJLM посредством множественных контактов и служит сборочной платформой для хвоста Полимеризация трубки/оболочки.PLoS Genet 11(10):
е1005545.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005545

Редактор: Патрик Х. Виолье, Медицинская школа Женевского университета, ШВЕЙЦАРИЯ

Получено: 9 января 2015 г.; Принято: 30 августа 2015 г.; Опубликовано: 13 октября 2015 г.

Copyright: © 2015 Brunet et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в пределах документ и его вспомогательные информационные файлы.

Финансирование: Работа выполнена при поддержке Национального центра научных исследований, Университета Экс-Марсель и грантов Национального агентства исследований (ANR-10-JCJC-1303-03 и ANR-14-CE14- 0006-02) в ЕС. YRB и AZ получили докторские стипендии от Министерства исследований Франции. AZ был поддержан стипендией Fondation pour la Recherche Médicale (FDT20140931060). Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

В окружающей среде бактерии ведут интенсивную войну. Бактерии сотрудничают или конкурируют за получение питательных веществ или за эффективную колонизацию ниши. Результат межбактериальных взаимодействий зависит от нескольких механизмов, включая кооперативное поведение или антагонистическую активность [1]. Недавно идентифицированная система секреции типа VI (T6SS) широко распространена среди протеобактерий и, как сообщается, играет ключевую роль в антагонизме между бактериальными сообществами [2-4].Хотя было показано, что для полной вирулентности по отношению к различным эукариотическим клеткам требуется несколько T6SS, большинство T6SS формируют бактериальные сообщества посредством межбактериальных взаимодействий [1]. В обоих случаях T6SS вводят токсичные эффекторы в клетки-мишени/реципиенты. Недавно был идентифицирован ряд антибактериальных токсинов, обладающих разнообразным репертуаром цитотоксической активности, таких как гидролазы пептидогликана, фосфолипазы или ДНКазы [1,5,6]. Доставка этих токсинов в периплазму или цитоплазму клетки-мишени приводит к быстрому лизису, который обычно происходит в течение нескольких минут [7-9].

На молекулярном уровне основной аппарат T6SS состоит из 13 консервативных субъединиц, которые образуют длинную цитоплазматическую трубчатую структуру, связанную с клеточной оболочкой транс-оболочечным комплексом [3,10-12]. Состав, структура и биогенез мембраносвязанного комплекса в последние годы хорошо охарактеризованы. Он состоит из трех белков: TssL, TssM и TssJ. Белки TssL и TssM взаимодействуют во внутренней мембране, тогда как периплазматический домен TssM контактирует с липопротеином внешней мембраны TssJ [13–15].Текущая модель считает цитозольный комплекс T6SS похожим на хвосты сократительных бактериофагов. Эти две родственные структуры имеют шприц для пункции клеток и сократительную оболочку, обертывающую внутреннюю трубку. Внутренняя трубка T6SS состоит из гексамеров ГПУ, уложенных друг на друга [16–18]. Шприц для прокалывания клеток собирается из тримера белка VgrG, на конце которого находится белок PAAR, и считается, что он закрывает трубку Hcp [16,19]. Эта структура структурно сравнима с хвостовой трубкой, состоящей из полимеризованных белков gp19, закрытых комплексом gp27-gp5, или концентратором, у бактериофага T4 [20].Белки TssB и TssC имеют структурное и функциональное сходство с оболочкой gp18 бактериофага T4 [8, 21–25]. Действительно, эксперименты с замедленной флуоресцентной микроскопией с использованием слияния TssB-GFP показали, что эти структуры очень динамичны: они собирают трубки микрометровой длины, которые последовательно расширяются за десятки секунд и сокращаются за несколько миллисекунд [8,9,26,27]. . Считается, что механизм сокращения аналогичен механизму сократительных бактериофагов [22–25]. Недавние анализы флуоресцентной микроскопии в смешанной культуре показали, что сокращение этой оболочечной структуры коррелирует с умерщвлением добычи [7-9].Основываясь на этих данных и на механизме заражения бактериофагами, современная модель предполагает, что сокращение оболочечной структуры продвигает внутреннюю трубку Hcp к клетке-мишени, что приводит к прокалыванию клеточной оболочки и доставке антибактериальных токсинов [3, 10,28]. У хвостатых фагов трубка и оболочка полимеризуются в структуре, называемой базовой пластинкой. Базальная пластинка бактериофага Т4 состоит из 140 полипептидных цепей не менее 16 различных белков. Эта очень сложная конструкция собирается из 6 клиньев, окружающих центральную ступицу.Семь белков образуют клинья базовой пластины (gp11, gp10, gp7, gp8, gp6, gp53 и gp25) [22,29-31]. Однако у других хвостатых бактериофагов, таких как P2, базальная пластинка значительно менее сложна, поскольку состоит только из четырех различных субъединиц: gpV (гомолог хаба) и клиновидных компонентов W (гомолог gp25), gpJ (gp6- подобное) и gpI [32,33]. Основываясь на этом наблюдении, Leiman & Shneider сформулировали концепцию минимальной сократительной хвостоподобной структуры [22]. В минимальном сократительном хвосте базовая пластина может быть значительно «упрощена», пока она выполняет свои основные функции: контроль сборки трубки, инициирование полимеризации оболочки и запуск сокращения оболочки.Тогда минимальная базовая пластина должна сохранять центральный узел и три других клиновидных белка: gp6, gp25 и gp53 [22]. Центральная втулка несет шип и действует как переходник с тройного на шестигранный, соединяющий хвостовую трубу. Gp25 инициирует полимеризацию оболочки. Gp6 соединяет клинья вместе, сохраняя целостность базовой пластины в процессе инфицирования. Роль gp53 остается неясной. Однако gp53 необходим для сборки gp25 на кольце gp6 [22]. В T6SS для сборки хвостовой трубы и оболочки должны использоваться компоненты, выполняющие аналогичные функции.За исключением TssE и VgrG, которые имеют поразительную гомологию с белком gp25 и комплексом gp27-gp5 hub соответственно, компоненты, которые собирают базовую пластинку T6SS, неизвестны. По аналогии с путем морфогенеза сократительных бактериофагов мы предположили, что сборка хвостовой трубки должна быть нарушена при отсутствии функциональной базальной пластинки. Поэтому недавно мы разработали биохимический подход, основанный на межмолекулярных дисульфидных связях, для исследования сборки Hcp трубки in vivo в цитоплазме энтероагрегативной Escherichia coli (EAEC) [18].Мы продемонстрировали, что гексамеры Hcp укладываются «голова к хвосту» с образованием добросовестных трубчатых структур in vivo [18]. Что еще более важно, точная организация стопки гексамеров Hcp стала неконтролируемой в отсутствие других компонентов T6SS. Здесь, используя коллекцию делеций неполярного гена T6SS, мы приводим доказательства того, что шесть белков T6SS необходимы для правильной сборки трубок Hcp: TssA, TssE, TssF, TssG, TssK и VgrG. Идентификация TssE и VgrG, двух известных гомологов компонентов базовой пластинки бактериофага, подтверждает экспериментальный подход. Далее мы охарактеризуем белки TssF и TssG. Мы сообщаем, что эти два белка взаимодействуют и стабилизируют друг друга и вступают в контакт с TssE, TssK и VgrG, а также с компонентами трубки и оболочки. Биоинформатический анализ предполагает, что TssF и TssG имеют сходство с белками J и I базовой пластинки бактериофага P2 соответственно. Эксперименты с флуоресцентной микроскопией также показывают, что функциональные белки GFP-TssF ( _sfGFP TssF) и TssK-GFP (TssK _sfGFP ) собираются в статические фокусы вблизи клеточной оболочки.Целостность фокусов _sfGFP TssF зависит от TssK, и его правильная локализация требует взаимодействия между TssF, TssG и цитоплазматической петлей TssM. Более того, эксперименты по совместной локализации с mCherry-меченым TssB демонстрируют, что кластеры _sfGFP TssF располагаются до рекрутирования субъединиц оболочки и остаются в основании оболочки во время растяжения и сжатия. Взятые вместе биохимические и цитологические подходы, представленные в этом исследовании, подтверждают роль TssE, TssF, TssG, TssK и VgrG в качестве компонентов базовой пластинки T6SS и последовательной иерархии рекрутирования (мембранный комплекс, базальная пластинка, хвостовая трубка/оболочка) во время биогенеза T6SS. .

Результаты

ЦсА, ЦсЭ, ЦсФ, ЦсГ, ЦсК и ВгрГ необходимы для правильной сборки трубы ГПУ

Используя подход межмолекулярного сшивания in vivo , основанный на образовании дисульфидных связей между соседними цистеиновыми остатками, мы недавно сообщили, что гексамеры EAEC Hcp организуются «голова к хвосту» с образованием трубчатых структур в цитоплазме EAEC. Важно отметить, что мы также продемонстрировали, что эти гексамеры укладываются случайным образом в штамме, в котором отсутствуют субъединицы Sci-1 T6SS, что приводит к конфигурациям «голова к хвосту», «хвост к хвосту» и «голова к голове» ([18], рис. 1A).Во время морфогенеза хвостатых бактериофагов структуры хвостовой трубки и оболочки полимеризуются на сборочной платформе, называемой базовой пластиной [22]. Кроме того, хвостовая трубка gp19 бактериофага T4 не полимеризуется в отсутствие полностью функциональной базовой пластинки [34]. По аналогии мы пришли к выводу, что аберрантная сборка гексамеров Hcp in vivo может сообщать о дефектной структуре, подобной базовой пластинке, в T6SS. Поэтому мы исследовали сборку Hcp в каждом неполярном штамме Δ tss (каждый из которых лишен существенной субъединицы Tss) с использованием анализа дисульфидной связи.В качестве доказательства концепции мы ранее показали, что шиповидный белок Sci-1 T6SS, VgrG, необходим для правильной сборки трубочек Hcp [18]. Помимо белка Hcp C38S без цистеина, были протестированы три комбинации для исследования укладки «голова к хвосту» (G96C-S158C), «хвост к хвосту» (Q24C-A95C) или «голова к голове» (G48C). Как сообщалось ранее, анализ SDS-PAGE цитоплазматических экстрактов из окисленных клеток Δ hcp , продуцирующих эти варианты, показал, что комбинация G96C-S158C «голова-хвост» приводит к образованию димеров и комплексов с более высокой молекулярной массой, в то время как комбинация «хвост-хвост» Комбинации Q24C-A95C и прямые комбинации G48C остаются строго мономерными (рис. 1А).Аналогичные результаты были получены для фонов tssB , tssC и clpV , что свидетельствует о том, что компоненты хвостовой оболочки не регулируют сборку хвостовой трубы (рис. 1В). Это согласуется с путем морфогенеза сократительных бактериофагов, у которых полимеризация хвостовой трубки непосредственно предшествует полимеризации оболочки. Важно отметить, что мы также наблюдали, что гексамеры Hcp должным образом собираются в цитоплазме мутантов tssJ , tssL и tssM (Fig. 1B).TssJ, TssL и TssM взаимодействуют с образованием транс-оболочечного комплекса, который закрепляет хвостоподобную структуру T6SS на мембранах [12-15]. Таким образом, правильная сборка структуры хвостовой трубки не зависит от мембранного комплекса, что согласуется с различной эволюционной историей мембранных и фаговых комплексов T6SS [2,35-37]. Однако контролируемая сборка трубок Hcp была нарушена в vgrG , tssA , tssE , tssF , tssG и tssK , взаимодействующих голова-к-хвосту в гексамерах Hcp. — хвостовая или головная упаковка (рис. 1В).Надлежащая сборка Hcp была восстановлена ​​в этих различных мутантных штаммах, когда аллель дикого типа отсутствующего гена экспрессировалась из комплементарных векторов (рис. 1C). Из этих результатов мы пришли к выводу, что шесть компонентов T6SS, и . и . VgrG, TssA, TssE, TssF, TssG и TssK повышают эффективность образования трубок in vivo и, следовательно, контролируют сборку трубочек Hcp. TssE и VgrG имеют структурную гомологию с белком gp25 и комплексом gp27-gp5 (концентратор) соответственно [16,19,35,38].Во время морфогенеза бактериофага Т4 сборка хвостовой трубки инициируется на базовой пластинке только после рекрутирования комплекса (gp27-gp5) hub, в то время как субъединица gp25 необходима для функциональной сборки базовой пластинки [39]. Наблюдение, что сборка Hcp была нарушена в клетках vgrG и tssE , таким образом, согласуется с путем сборки бактериофагов и дополнительно подтверждает первоначальную гипотезу о том, что надлежащая полимеризация трубок Hcp зависит от структуры, подобной базовой пластине.На основании этих наблюдений мы предположили, что TssA, TssF, TssG и TssK могут образовывать вместе с TssE и VgrG платформу, сходную с базовой пластинкой бактериофага. Однако в то время как субъединицы TssE, TssK и VgrG были ранее охарактеризованы [16, 38, 40], имеется мало информации о TssA, TssF и TssG. Исследование биоинформатики, опубликованное Boyer et al . продемонстрировали высокий уровень совпадения генов tssE (COG3518), tssF (COG3519) и tssG (COG3520). tssE и tssF генетически связаны в 87% кластеров генов T6SS, тогда как совместная организация tssF и tssG происходит в 97% этих кластеров ([2], рис. 2А). Как отметили Бойер и соавторы [2], одновременное появление обычно отражает белок-белковые взаимодействия. Действительно, ниже мы покажем, что TssF и TssG являются двумя компонентами базовой платы T6SS. Напротив, в этом исследовании не было замечено совместного появления гена tssA (COG3515) с tssE , vgrG или hcp .Хотя TssA необходим для формирования трубки Hcp, мы сообщим в другом месте, что он не является компонентом T6SS per se (Zoued, Durand et al. ., в процессе подготовки). Поэтому мы сосредоточили нашу дальнейшую работу на двух неохарактеризованных генах tssF и tssG .

Рис. 1. Дефекты сборки Hcp в мутантных клетках vgrG , tssA , tssK , tssE , tssF и tssG .

(A) Экстракты клеток WT или Δ sci-1 EAEC, продуцирующих Hcp C38S (дорожка 1,-), Hcp C38S G96C S158C (дорожка 2, для исследования упаковки «голова к хвосту», HT), Hcp C38S Q24C A95C (дорожка 3, для исследования упаковки «голова к голове», HH) или Hcp C38S G48C (дорожка 4, для исследования упаковки «хвост к хвосту», TT) после окислительной обработки in vivo фенантролином меди.(B) и (C) Экстракты из клеток EAEC Δ tss (B) или клеток Δ tss , продуцирующих недостающий ген из комплементационных векторов pBAD33 ( tss +) (C) и продуцирующих Hcp C38S (-), Hcp C38S G96C S158C (дорожка 2, HT), Hcp C38S Q24C A95C (дорожка 3, HH) или Hcp C38S G48C (дорожка 4, TT) после окислительной обработки in vivo фенантролином меди. Образцы разделяли на SDS-ПААГ с 12,5%-ным акриламидом, а комплексы Hcp и Hcp подвергали иммунодетекции с моноклональным антителом против FLAG.Маркеры молекулярной массы указаны справа.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005545.g001

Рис. 2. Гены tssE , tssF и tssG встречаются совместно в кластерах генов T6SS и имеют общие гомологии с компонентами базовой пластинки фага.

(A) Схематическое представление генов tssE , tssF и tssG с соответствующими номерами COG (кластеры ортологичных групп [59]). Указана также гомология между TssE и белком gp25 бактериофага Т4.Число на черной полосе между двумя генами указывает на уровень одновременной встречаемости двух генов в бактериальных геномах (адаптировано из [2]). (B) Схематические изображения семейств белков PHA02553 и TIGR02243 (с репрезентативными членами — клиновидными белками gp6 бактериофага T4 и gpJ бактериофага P2 соответственно) и TssF. Указано количество аминокислотных остатков для каждого белка, а также фрагмент gp6, для которого имеется кристаллическая структура (PDB 3h3T, [48]). Области гомологии между различными белками обозначены серыми областями (указаны границы аминокислотных остатков). (C) и (D) Крупные планы областей гомологии между TssF, PHA02553 и TIGR02243 и между TssG и TIGR02242 (представитель: клиновидный белок gpI из бактериофага P2). Указаны предсказанные вторичные структуры (зеленый, -спираль; красный, -тяж). Серые области обозначают области гомологии (указаны границы аминокислотных остатков).

https://дои.org/10.1371/journal.pgen.1005545.g002

ЦсФ и ЦсГ являются составными частями базовой платы T6SS

Биоинформатический анализ: TssF и TssG являются гомологами хвостовых белков фага. Чтобы получить дополнительное представление о TssF и TssG, мы провели биоинформатический анализ с использованием HHPred (обнаружение гомологии и предсказание структуры, [41]). Белковые последовательности Sci-1 EAEC TssF (номер доступа: EC042_4542; идентификатор гена: 387609963) и TssG (номер доступа: EC042_4543; идентификатор гена: 387609964) использовали в качестве приманок для идентификации гомологов в бактериофагах. Анализы HHpred с TssF показали, что фрагмент, содержащий остатки 7–144 (более 587), напоминает область 9–132 фагового хвостоподобного белка TIGR02243 (PFAM04865), прототипом которого является белок J фага P2. Сегмент, включающий остатки 86–179, также имеет общие вторичные структуры с остатками 89–178 gp6, клиновидного компонента базовой пластинки бактериофага T4 (Fig. 2B и 2C). Точно так же фрагмент TssG, содержащий остатки 37–152 (более 303), напоминает область 4–110 фагового хвостоподобного белка TIGR02242 (PFAM09684), прототипом которого является белок I фага P2 (рис. 2D).Базовая пластинка фага Р2 состоит из четырех субъединиц: V, W, I и J [32]. Белок V является гомологом комплекса gp27-gp5 бактериофага T4 (VgrG) [42], тогда как белок W является гомологом gp25 (TssE). Leiman & Shneider недавно выдвинули гипотезу о том, что базовая пластинка с минимальной сократительной структурой собирается из центрального узла (gp27-gp5 и белка V у бактериофагов T4 и P2 соответственно) и трех ключевых клиновидных белков (gp25, gp6 и gp53) у бактериофага T4. ; Белки W, I и J бактериофага Р2) [22].Предсказанная структурная гомология предполагает, что N-концевая область TssF соответствует N-концевой области gp6, тогда как TssG (и белок I фага P2) соответствует gp53. Поэтому мы предполагаем, что базовая пластинка T6SS состоит как минимум из четырех субъединиц (VgrG (gp27-gp5; V), TssE (gp25; W), TssF (gp6; J) и TssG (gp53; I).

Функция

T6SS: TssF и TssG необходимы для полимеризации оболочки и высвобождения Hcp. Серия элегантных исследований, сочетающих генетические и биохимические подходы к визуализации с помощью электронной микроскопии, продемонстрировала, что во время морфогенеза частиц бактериофагов отсутствие компонентов базовой пластины предотвращает полимеризацию внутренней трубки и внешней оболочки [31,39,43–45].Здесь мы следили за динамикой хромосомно-кодируемого слитого белка TssB-mCherry (TssB _mCh ) с использованием покадровой флуоресцентной микроскопии. Мы наблюдали, что сборка оболочки отменяется в клетках tssF и tssG (рис. S1A). В соответствии с отсутствием полимеризации и сжатия оболочки вестерн-блот-анализ культуральных супернатантов показал, что клетки tssF и tssG не выделяют Hcp в среду (S1B Fig).

Сеть взаимодействия: TssF и TssG взаимодействуют с TssE, VgrG, TssK, Hcp и TssC.Чтобы получить дополнительную информацию о партнерах TssF и TssG, мы использовали систематический подход, основанный на бактериальном двухгибридном (BTH). Трансляционные слияния T18-TssF/G и TssF/G-T18 тестировали в отношении родственных фагам основных компонентов T6SS (TssB, TssC, Hcp, TssE, VgrG и TssA), слитых с доменом T25. Как показано на рис. 3А, TssF взаимодействует с Hcp, тогда как TssG взаимодействует с TssC, Hcp и TssE. Затем эти парные взаимодействия тестировали коиммунопреципитацией в гетерологичном хозяине E . кишечная палочка К-12.На фиг. 3B показано, что Hcp, меченный HA, подвергался совместной иммунопреципитации с TssF или TssG, меченным FLAG. На рис. 3C показано, что TssG, меченный HA, коиммунопреципитировался с TssE, меченным FLAG. Интересно, что меченный HA TssF также специфически коиммунопреципитировался с TssE (рис. 3D), хотя анализ BTH не смог обнаружить это взаимодействие. Взятые вместе, анализы BTH и ко-иммунопреципитации свидетельствуют о том, что TssF и TssG взаимодействуют с компонентами хвоста T6SS, включая белок базовой пластинки TssE, а также с белками трубочки и оболочки Hcp и TssC.Эти данные предоставляют дополнительные доказательства в поддержку анализа сборки Hcp и биоинформатического анализа, чтобы предположить, что TssF и TssG образуют с TssE и VgrG базовую пластину T6SS, на которой полимеризуются трубка (Hcp) и оболочка (TssBC).

Рис. 3. TssF и TssG взаимодействуют с фагоподобными компонентами T6SS.

(A) Бактериальный двухгибридный анализ. Репортерные клетки BTh201, продуцирующие указанные белки, слитые с доменом Т18 или Т25 аденилатциклазы Bordetella , наносили на чашки с добавлением ИПТГ и хромогенного субстрата X-Gal.Взаимодействие между двумя слитыми белками подтверждается синим цветом колонии. Взаимодействие TolB-Pal служит положительным контролем. (B, C, D) анализы ко-иммунопреципитации. (B) TssF и TssG взаимодействуют с трубкообразующим белком Hcp. Растворимые экстракты E . Штамм coli K-12 W3110, продуцирующий TssF или TssG, меченный FLAG, и Hcp, меченный HA, подвергали иммунопреципитации с помощью гранул, связанных с анти-FLAG. Исходный материал (общий растворимый материал, T) и иммунопреципитированный материал (IP) загружали на 12.5%-акриламид SDS-PAGE и иммунодетекция с моноклональными антителами против FLAG и против HA. Иммунодетектируемые белки указаны справа. Маркеры молекулярной массы указаны слева. (C и D) TssG (C) и TssF (D) взаимодействуют с gp25-подобной субъединицей TssE. Растворимые экстракты E . Штамм coli K-12 W3110, продуцирующий TssF, меченный HA, и TssE, меченный FLAG, или TssG, меченный VSV-G, и TssE, меченный FLAG (правая панель), подвергали иммунопреципитации с использованием гранул, связанных с анти-FLAG.Исходный материал (общий растворимый материал, T) и иммунопреципитированный материал (IP) загружали в SDS-PAGE с 12,5% акриламидом и подвергали иммунодетекции с помощью моноклональных антител против FLAG, против HA и против VSV-G. Иммунодетектируемые белки указаны справа. Маркеры молекулярной массы указаны слева. Звездочками обозначены легкие или тяжелые цепи антител. (E) Эксперименты по восстановлению. Очищенные лизаты клеток, продуцирующих VgrG-OB _VSVG , TssE _FL , TssF _FL или TssG _FL , смешивали, как указано (+), и комплексы подвергали иммунопреципитации с анти-VSV-G-связанными шариками.Иммунопреципитированные материалы загружали в SDS-PAGE с 12,5%-ным акриламидом и подвергали иммунодетекции с помощью моноклональных антител против VSV-G (верхняя панель) и против FLAG (нижняя панель). Mixes были TSSE _FL , TSSF _FL и TSSG _FL в одиночку (LANE 1) или VGRG-OB _VSVG с TSSE _FL , TSSF _FL и TSSG _FL (Lane 2) или с TSSF _ФЗ и ЦсГ _ФЗ (полоса 3). Звездочками обозначены легкие или тяжелые цепи антител. (F) Бактериальный двухгибридный анализ.Репортерные клетки BTh201, продуцирующие указанные белки, слитые с доменом Т18 или Т25 аденилатциклазы Bordetella , и третьего партнера наносили на чашки с добавлением ИПТГ и хромогенного субстрата X-Gal. Взаимодействие TolB-Pal служит положительным контролем.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005545.g003

У бактериофагов, таких как T4, шесть клиньев, образованных комплексом gp6-gp25-gp53, собираются вокруг центральной втулки. Поэтому мы проверили, взаимодействует ли комплекс TssE-F-G с VgrG, используя подход восстановления.Лизаты клеток, продуцирующих VgrG, меченный эпитопом VSV-G, и TssE, -F и -G, меченные FLAG, смешивали перед иммунопреципитацией на смоле против VSV-G. На рис. 3Е показано, что VgrG эффективно осаждает TssE, -F и -G. На основании этого результата и бактериального двухгибридного подхода (рис. 3А) мы предположили, что TssE связывает VgrG и TssF/TssG. Поэтому мы повторили эксперименты по иммунопреципитации в отсутствие TssE. Однако в этих условиях мы также наблюдали, что и TssF, и TssG ко-иммунопреципитируют с VgrG (рис. 3E).Поскольку мы не обнаружили прямых взаимодействий VgrG-TssF и VgrG-TssG в анализах BTH и ко-иммунопреципитации, эти результаты предполагают, что образование комплекса TssF-TssG необходимо для взаимодействия с VgrG. Действительно, эксперименты BTH показали, что взаимодействия VgrG-TssF и VgrG-TssG обнаруживаются, когда присутствует третий партнер, TssG и TssF соответственно (рис. 3F). Недавно сообщалось о стабильном комплексе TssKFG [46]. Однако мы не наблюдали взаимодействия между TssK и TssF или TssG ни в этом исследовании, ни при изучении систематического взаимодействия TssK [40].Интересно, что дальнейшие эксперименты с BTH показали, что и TssF, и TssG необходимы для стабильного взаимодействия с TssK (рис. 3F), аналогично тому, что мы наблюдали для VgrG. Таким образом, мы заключаем, что образование субкомплекса TssFG является предпосылкой для дальнейших взаимодействий с VgrG и TssK.

ЦсФ и ЦсГ взаимодействуют и стабилизируют друг друга

Описанные выше эксперименты и генетическое сцепление генов tssF и tssG позволяют предположить, что TssF и TssG взаимодействуют.Чтобы проверить эту гипотезу, мы сначала выполнили эксперименты по стационарной стабильности в E . coli Клетки К-12, продуцирующие TssF, TssG или оба TssF и TssG. Клетки собирали в разные моменты времени после ингибирования синтеза белка и оценивали стабильность TssF и TssG с помощью вестерн-блоттинга. На фиг. 4А показано, что TssF и TssG, когда они продуцируются отдельно, являются относительно нестабильными белками, поскольку TssF и TssG не обнаруживаются через 120 и 60 минут после ингибирования синтеза белка соответственно.Однако оба белка стабилизировались при совместном продуцировании и оставались обнаруживаемыми до 8 часов после остановки синтеза белка. Этот результат показывает, что TssF и TssG стабилизируют друг друга. Совместная стабилизация этих двух белков согласуется с недавней работой, показывающей, что белки Serratia TssF и TssG нестабильны в отсутствие другого [46]. Чтобы проверить прямое взаимодействие, мы провели эксперименты с BTH и ко-иммунопреципитацией. Во-первых, анализ BTH показал, что (i) как TssF, так и TssG участвуют в гомотипических взаимодействиях, предполагая, что эти белки димеризуются или мультимеризуются, и (ii) что эти два белка взаимодействуют (Fig 4B). Однако расположение слияния на С-конце TssF или на N-конце TssG вызывает стерические затруднения, препятствующие образованию комплекса TssF-TssG. Кроме того, белок TssF, меченный эпитопом HA, был специфически коиммунопреципитирован с TssG, меченным FLAG, в гетерологичном хозяине T6SS ^— E . coli K-12 (рис. 4C), демонстрируя, что это взаимодействие не опосредовано другими компонентами T6SS. В совокупности эти эксперименты демонстрируют, что TssF и TssG образуют комплекс, стабилизирующий обе субъединицы.Интересно, что в составе уропатогенного E . Кластер генов coli (UPEC) CFT073 T6SS, гены tssF и tssG сливаются, что приводит к химерному гену tssF’-‘tssG (см. рис. 4D). Выравнивание последовательности белка Clustal W белков EAEC TssF и TssG со слитым UPEC TssF-G показало, что С-концевые остатки PG TssF сливаются с N-концевыми остатками MGFP TssG с образованием мотива PGMGFP в слитом белке. (см. S2 рис.). Чтобы проверить, может ли слитый белок быть функциональным в EAEC, мы сконструировали мутантный штамм Δ tssFG и слили гены tssF и tssG в рамке считывания либо в нативном (FG-слияние), либо в противоположной ориентации (GF-слияние). ).Оба слитых белка накапливались в сопоставимых количествах. Гены tssF и tssG также были клонированы непрерывно, имитируя их естественную генетическую организацию (F+G) в EAEC. Как и ожидалось, T6SS был нефункциональным в клетках Δ tssFG , поскольку Hcp не высвобождался ни в супернатанте культуры, ни в супернатанте клеток Δ tssFG , продуцирующих только TssF или TssG. Фенотип WT восстанавливался при продукции как TssF, так и TssG или слитого белка TssF-TssG; однако продукция «инвертированного» слитого белка TssG-TssF не смогла дополнить мутацию Δ tssFG (рис. 4E).В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что TssF и TssG взаимодействуют. Наблюдение за тем, что слитый белок TssF-TssG является функциональным, предполагает, что TssF и TssG образуют субкомплекс со стехиометрией 1:1. Однако, используя количественное окрашивание геля, English et al . недавно сообщили о молярном соотношении 2:1 для комплекса Serratia TssF:G [46]. Хотя наши данные предполагают стехиометрию 1:1, мы не можем исключить, что сконструированный нами слитый белок TssF-G подвергается частичной деградации.У бактериофага Т4 отмечено соотношение 2:1 для комплекса gp6:gp53 [31], что согласуется с данными Serratia [46].

Рис. 4. ЦсФ и ЦсГ взаимодействуют и стабилизируют друг друга.

(A) ЦсФ и ЦсГ стабилизируются при совместном производстве. Стационарные уровни белков TssF _HA и TssG _FL , продуцируемых по отдельности или вместе, анализировали с помощью вестерн-блоттинга целых клеток с использованием моноклональных антител против HA или против FLAG. Стабильный липопротеин Pal использовали в качестве контроля нагрузки.Указаны инкубационные периоды (мин) после обработки спектиномицином/хлорамфениколом. (B) Бактериальный двухгибридный анализ. Репортерные клетки BTh201, продуцирующие указанные белки, слитые с доменом Т18 или Т25 аденилатциклазы Bordetella , наносили на чашки с добавлением IPTG и хромогенного субстрата Бромо-хлор-индолил-β-D-галактопиранозид. Взаимодействие между двумя слитыми белками подтверждается синим цветом колонии. Взаимодействие TolB-Pal служит положительным контролем.(C) TssF ко-иммунопреципитирует с TssG. Растворимые экстракты E . Штамм coli K-12 W3110, продуцирующий TssF _HA и TssG _FL , подвергали иммунопреципитации гранулами, связанными с анти-FLAG. Общий растворимый материал (T) и иммунопреципитированный материал (IP) наносили на SDS-PAGE с 12,5%-ным акриламидом и подвергали иммунодетекции с помощью моноклональных антител против HA и против FLAG. Иммунодетектируемые белки указаны справа. Маркеры молекулярной массы указаны слева.(D) Генетическая организация генов tssF и tssG в EAEC 17-2 и E . coli УПЭК CFT073. Ортологичные гены схематично показаны одним цветом. Выравнивание Clustal W между EAEC TssF и TssG и белком CFT073 NP_755275 представлено на рис. S2. (E) Слитый белок TssF-TssG является функциональным. Высвобождение Hcp _FLAG оценивали путем разделения фракций целых клеток (C) и супернатантов (S) из культур клеток WT, tssFG и комплементарных tssFG . Клетки tssFG комплементировали либо плазмидой, несущей гены tssF и tssG , расположенные непрерывно (F+G), либо слияние tssF’-‘tssG (FG), либо слияние tssG’-‘tssF ГФ). В общей сложности 2×10 ⁸ клеток и ТХУ-преципитированный материал супернатанта из 5×10 ⁸ клеток наносили на SDS-PAGE с 12,5%-ным акриламидом и подвергали иммунодетекции с использованием моноклонального антитела против FLAG (нижняя панель). ) и поликлональные антитела против TolB (контроль целостности клеток; верхняя панель).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005545.g004

TssF и TssG представляют собой растворимые цитоплазматические субъединицы, рекрутируемые в IM с помощью TssM

Чтобы получить представление о TssF и TssG, мы дополнительно проверили их субклеточную локализацию, используя эксперименты по клеточному фракционированию. В клетках дикого типа как TssF, так и TssG в основном совместно фракционируются с EFTu, цитоплазматическим фактором удлинения (рис. 5А). Неожиданно было обнаружено, что небольшие, но воспроизводимые количества TssF и TssG связаны с мембранной фракцией (рис. 5А).TssF и TssG совместно фракционируют с белком IM TolA, а активность NADH-оксидазы в экспериментах с градиентом плотности седиментации указывает на то, что оба белка связываются с внутренней мембраной (IM) (рис. 5B). Эти результаты свидетельствуют о том, что TssF и TssG периферически связаны с IM, вероятно, посредством белок-белковых контактов. Интересно, что оба белка локализованы исключительно в цитоплазматических фракциях E . coli K-12 ( i . e ., лишенных генов T6SS) (рис. 5C), что еще раз подтверждает мнение о том, что TssF и TssG связаны с внутренней мембраной компонентом T6SS.

Рис. 5. TssF и TssG представляют собой растворимые белки, которые связываются с IM посредством контактов между TssG и цитоплазматической петлей TssM.

(A) Процедура фракционирования была применена к клеткам EAEC, продуцирующим TssF _HA и TssG _FL (T, общая фракция), что позволило разделить периплазматическую (P), цитоплазматическую (C) и мембранную фракции (M) . Образцы загружали в SDS-PAGE с 12,5% акриламидом и иммунодетектировали антителами, направленными против белков EFTu (цитоплазма), TolB (периплазма), белков OmpA (OM) и эпитопа HA TssF или эпитопа FLAG TssG.Маркеры молекулярной массы указаны слева. (B) Тотальные мембраны (T) из клеток EAEC, продуцирующих TssF _HA и TssG _FL , разделяли в градиенте прерывистой седиментации сахарозы. Собранные фракции анализировали на содержание с использованием поликлональных антител анти-TolA и анти-OmpA или моноклональных антител анти-HA и анти-FLAG. Кроме того, тест активности НАДН-оксидазы (график) использовали в качестве репортера фракций, содержащих белок внутренней мембраны. Активность НАДН-оксидазы представлена ​​относительно общей активности.Указано положение фракций, содержащих внутреннюю и внешнюю мембраны. (C) Процедура фракционирования была применена к E . Клетки coli K-12 W3110, продуцирующие TssF _HA и TssG _FLAG (T, общая фракция), позволяют разделить периплазму (P), цитоплазму (C) и мембранные фракции (M). Образцы загружали в SDS-PAGE с 12,5% акриламидом и подвергали иммунодетекции антителами, направленными против белков EFTu (цитоплазма), TolB (периплазма), TolA (IM) и эпитопа HA TssF или эпитопа FLAG TssG.Маркеры молекулярной массы указаны слева. (D) Бактериальный двухгибридный анализ. Репортерные клетки BTh201, продуцирующие указанные белки, слитые с доменом Т18 или Т25 аденилатциклазы Bordetella , наносили на чашки с добавлением IPTG и хромогенного субстрата Бромо-хлор-индолил-β-D-галактопиранозид. Взаимодействие между двумя слитыми белками подтверждается синим цветом колонии. Взаимодействие TolB-Pal служит положительным контролем. (E) TssG ко-иммунопреципитирует с цитоплазматическим доменом TssM (TssMc, аминокислоты 82–360).Растворимые экстракты E . Штамм coli K-12 W3110, продуцирующий только TssG _VSVG , или TssG _VSVG и TssMc _FL подвергали иммунопреципитации с использованием гранул, связанных с анти-FLAG. Общий растворимый материал (T) и иммунопреципитированный материал (IP) наносили на SDS-PAGE с 12,5%-ным акриламидом и иммунодетектировали с помощью моноклональных антител против VSVG и против FLAG (дополнительные полосы соответствуют тяжелым цепям антител). Иммунодетектируемые белки указаны справа.Маркеры молекулярной массы указаны слева. (F) TssF и TssG остаются цитоплазматическими в делеционном мутанте tssM . Процедура фракционирования была применена к клеткам EAEC tssM , совместно продуцирующим TssF _HA и TssG _FL (T, общая фракция), что позволило разделить периплазму (P), цитоплазму (C) и мембранные фракции (M). . Образцы загружали в SDS-PAGE с 12,5% акриламидом и подвергали иммунодетекции антителами, направленными против белков EFTu (цитоплазма), TolB (периплазма), TolA (IM) и эпитопа HA TssF или эпитопа FLAG TssG.Маркеры молекулярной массы указаны слева.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005545.g005

Три белка T6SS взаимодействуют, образуя ассоциированный с мембраной комплекс, который охватывает клеточную оболочку: белки внутренней мембраны TssL и TssM и липопротеин внешней мембраны TssJ [12–15]. Чтобы идентифицировать партнеров TssF и TssG, мы проверили их взаимодействие с растворимыми доменами TssL, TssM и TssJ с помощью BTH. Как показано на рис. 5D, TssG взаимодействует с цитоплазматической петлей белка внутренней мембраны TssM (TssMc).Этот результат был подтвержден ко-иммунопреципитацией: меченный HA TssG подвергался ко-иммунопреципитации с доменом TssMc, меченным FLAG (фиг. 5E). Гипотеза о привлечении TssF и TssG к мембране посредством взаимодействия с TssM была проверена путем клеточного фракционирования в клетках Δ tssM . На рис. 5F показано, что в отсутствие TssM, TssF и TssG кофракционируют исключительно с цитоплазматическим маркером EFTu и больше не связываются с мембранной фракцией. В совокупности эти данные показывают, что TssF и TssG рекрутируются на цитоплазматической поверхности внутренней мембраны посредством взаимодействия с цитоплазматической петлей TssM.Однако ассоциация с мембранным комплексом может быть стабилизирована дополнительными контактами, включающими взаимодействия TssFG-TssK и TssK-TssL или TssK-TssM [40].

ЦсФ собирает стабильные и статические кластеры, на которых полимеризуется оболочка

Предыдущие данные свидетельствуют о том, что TssE,-F,-G,-K, VgrG собирают структуру базовой пластины, прикрепленную к мембранному комплексу T6SS. Основываясь на знаниях о бактериофагах, мы предположили, что эта базовая пластина служит сборочной платформой для удлинения хвостовой трубки / оболочки.Чтобы дополнительно получить информацию о расположении компонентов базовой пластины в клетках, рекрутировании и динамическом поведении, мы сконструировали штаммы, продуцирующие суперпапку GFP (sfGFP), слитую с N- или C-концом TssE, TssF, TssG и TssK. Все эти хромосомные конструкции были введены в нативные исходные локусы. Только слияния GFP-TssF ( _sfGFP TssF) и TssK-GFP (TssK _sfGFP ) были функциональными. В клетках дикого типа _sfGFP TssF образует 1–3 очага на клетку, расположенные близко к цитоплазматической стороне оболочки и с ограниченной динамикой (рис. 6А [верхняя панель] и S3A и S3B).Количество очагов _sfGFP TssF и их динамика остались неизменными в клетках tssBC , что свидетельствует о том, что сборка оболочки T6SS не влияет на формирование этих структур (рис. 6A и S3A и S3B). Напротив, флуоресценция _sfGFP TssF была диффузной в клетках tssK , демонстрируя, что TssK необходим для правильной сборки базовых пластин, содержащих TssF (рис. 6А). Поведение _sfGFP TssF отличалось в клетках tssM . Хотя ~ 95% клеток имеют диффузную флуоресценцию, кластеры _sfGFP TssF присутствуют в ~ 5% клеток.Эти кластеры не остаются тесно связанными с мембраной, а скорее демонстрируют случайную динамику (Fig. 6A), указывая на то, что мембранные комплексы стабилизируют и закрепляют комплексы базовой пластины на IM.

Рис. 6. ЦсФ и ЦсК собираются в статические очаги, которые служат платформой для полимеризации оболочки.

(A) Покадровые записи флуоресцентной микроскопии, показывающие локализацию и динамику функционального слитого белка _sfGFP TssF в клетках дикого типа (WT) (верхняя панель) или tssBC (вторая панель сверху) tssK ( третья панель сверху) или производные цсм (нижняя панель). Отдельные изображения делались каждые 30 секунд. Положения фокусов обозначены белыми треугольниками. Шкала баров составляет 1 м. Статистический анализ (количество очагов на клетку и динамика) показан на рисунках S3A и S3B. (B) События полимеризации оболочки инициируются в очагах _sfGFP TssF. Покадровая запись флуоресцентной микроскопии клеток EAEC дикого типа, продуцирующих _sfGFP TssF и TssB _mCh . Показаны канал GFP (верхняя панель), канал mCherry (средняя панель) и каналы слияния (нижняя панель).Отдельные изображения (слева направо) делались каждые 30 секунд. Очаги базальной пластинки и дистальные концы влагалищ обозначены белыми стрелками. Схематическая диаграмма, обобщающая наблюдаемые события, приведена ниже. Масштабная линейка составляет 1 мкм. Статистический анализ (исходное расположение кластеров _sfGFP TssF, процент оболочек с базальными фокусами _sfGFP TssF) и кимографический анализ показаны на S3C, S3D и S3E. Рис. (C) Интервальная флуоресцентная микроскопия, показывающая локализацию и динамику функциональный слитый белок TssK _sfGFP в клетках дикого типа (WT) (верхняя панель) или его производное tssM (нижняя панель). Отдельные изображения делались каждые 30 секунд. Положения фокусов обозначены белыми треугольниками. Шкала баров составляет 1 м. Статистический анализ (количество очагов на клетку и динамика) показан на S3B и S3F. Рис. (D) Покадровые записи флуоресцентной микроскопии, показывающие локализацию и динамику функционального слитого белка _sfGFP TssM в клетках tssK . Отдельные изображения делались каждые 30 секунд. Положения фокусов обозначены белыми треугольниками. Шкала баров составляет 1 м.Статистический анализ (количество очагов на клетку) показан на рис. S3G. (E) Путь сборки между выбранными компонентами T6SS. Мембранный комплекс (МК), включающий белок TssJLM (показан электронной микроскопией структуры 11,6-А), собирается первым и используется в качестве стыковочной станции для TssK. TssK набирает комплекс TssF/TssG в аппарат для сборки комплекса базовой пластины (BC, зеленый прямоугольник) перед сборкой хвостового комплекса (TC, красный прямоугольник), включающего внутреннюю трубку Hcp и сократительную структуру, подобную оболочке TssBC.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005545.g006

Записи флуоресцентной микроскопии клеток, продуцирующих как _sfGFP TssF, так и mCherry-меченый TssB (TssB _mCh ) из их нативных локусов хромосом Механизм T6SS: i) кластеры _sfGFP TssF располагаются первыми (рис. 6B и S3C), и ii) оболочка TssB _mCh простирается от предварительно собранного кластера _sfGFP TssF (рис. 6B и S3D и S3E).Кроме того, записи показывают, что _{фокусов sfGFP и} TssF остаются связанными с оболочкой в ​​течение всего цикла (удлинение, сокращение и разборка) (рис. S3C и S3D). Эти наблюдения убедительно подтверждают модель, в которой комплексы, содержащие TssF, служат платформами для полимеризации оболочек. Слияние TssK _sfGFP демонстрирует сходное поведение с _sfGFP TssF: оно собирает 1–3 стабильных и статических очага на клетку и демонстрирует диффузную локализацию в отсутствие TssM (рис. 6C и S3B и S3F). Наоборот, _sfGFP TssM образует дискретные очаги в клетках WT [15], которые собираются независимо от TssK (Figs 6D и S3G). Основываясь на этих результатах и ​​в согласии с гипотезой, выдвинутой Инглишем и соавторами [46], мы предполагаем, что мембранный комплекс TssL-MJ служит местом стыковки хвостоподобной структуры T6SS, сборка которой начинается с последующие наборы TssK, TssFG, Hcp и TssBC (рис. 6E).

Обсуждение

Недавние исследования показали, что T6SS собирает цитозольную структуру, подобную хвостовой трубке и оболочке сократительных бактериофагов [16,23–26].Во время морфогенеза бактериофага трубка и оболочка полимеризуются на базовой пластине, которая инициирует и направляет процесс сборки [29-31]. Кроме того, базовая пластинка претерпевает большие конформационные перестройки при приземлении на клетку-мишень, что в конечном итоге вызывает сокращение хвоста [30]. У бактериофага Т4 базальная пластинка представляет собой сложную структуру; однако простейшие базовые пластины существуют и у других сократительных бактериофагов. Основываясь на сравнении базовых пластинок, Leiman & Shneider предположили, что для функциональной базовой пластинки потребуются только четыре компонента: комплекс узлов gp27-gp5 (или шип) и клиновидные субъединицы gp25, gp6 и gp53 [22].Тем не менее, в T6SS неизвестна идентичность и состав базовой пластины, которая контролирует сборку конструкции трубка/оболочка [10–12,37]. Чтобы идентифицировать эти компоненты, мы разработали тест для исследования образования трубок Hcp in vivo [18]. Систематически применяя этот анализ во всех мутантных штаммах с делецией гена T6SS, мы идентифицировали шесть основных компонентов T6SS, необходимых для контролируемой полимеризации трубки Hcp. Этот экспериментальный подход был подтвержден тем фактом, что мы идентифицировали VgrG и TssE, гомологи T6SS комплекса шип/концентратор бактериофага и субъединицы gp25 соответственно.Среди четырех оставшихся субъединиц, TssA, TssK, TssF и TssG, мы показали, что две последние имеют ограниченную, но значительную гомологию с белками J и I, двумя компонентами базовой пластинки фага P2, соответственно [32,33]. В дополнение к бактериофагам и T6SS, гомологи белков I и J базисной пластинки Р2, а также гомологи шипа/хаба и gp25 обнаружены в антипитающих профагах, кассетах Photorhabdus Virulence и R-пиоцинах [47], что позволяет предположить, что они, вероятно, представляют собой ядро ​​механизмов транслокации фагоподобных белков.Схематическое сравнение гомологии и контактов между компонентами бактериофага T4 и T6SS показано на рис. S4. В этом исследовании мы сосредоточили нашу работу на белках TssF и TssG. Мы показали, что ЦсФ и ЦсГ взаимодействуют друг с другом и с ЦсЭ. Хотя мы не рассматривали биологическую значимость этих взаимодействий, эти результаты согласуются с совместным присутствием этих трех генов в кластерах генов T6SS [2], а также с наблюдением, что гомологи TssE и TssF бактериофага T4 – gp25 и gp6 – взаимодействуют [48].Интересно, что Aksyuk и соавт. показали, что взаимодействие gp6-gp25 включает N-концевой фрагмент gp6, фрагмент, имеющий гомологию с TssF [48]. Кроме того, были обнаружены контакты с TssK, VgrG и компонентами трубки (Hcp) и оболочки (TssC). Интересно, что контакты с TssK и VgrG требуют предварительного формирования комплекса TssF-G. В совокупности эти данные подтверждают идею о том, что базальная пластинка T6SS состоит из субъединиц VgrG, TssE, TssF, TssG и TssK, на которых последовательно полимеризуются трубка Hcp и оболочка TssB-TssC (рис. 7).Действительно, исследования совместной локализации показали, что TssF рекрутируется в аппарат до наращивания интродьюсера. Судя по наблюдениям, что эта базальная пластина пристыкована к мембранному комплексу и остается в основании вытянутого хвоста, она, вероятно, соответствует структуре, наблюдаемой в том же месте на электронных криотомографах T6SS [26].

Рис. 7. Сборка секреторной системы типа VI.

Схематическое изображение различных стадий биогенеза T6SS. Мембранный комплекс TssJ-LM сначала собирается в клеточной оболочке (IM, внутренняя мембрана; PG, пептидогликан; OM, внешняя мембрана) и рекрутирует подобную базовой пластине сборочную платформу, состоящую из TssE, TssF, TssG, TssK, VgrG и, возможно, TssA. (платформа в виде зеленого диска с зеленым винтом VgrG).Полимеризация хвостовой трубы (кольца Hcp, черные прямоугольники) и оболочки (нити TssBC, красные прямоугольники) начинается после завершения платформы.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005545.g007

Пути сборки фагового клина и базовой пластинки регулируются поэтапным добавлением различных субъединиц в строгом порядке [39,44]. Что касается биогенеза T6SS, представленные здесь результаты, а также три недавних исследования [15, 40, 46] подтверждают предположение о том, что сначала собирается мембранный комплекс TssLMJ и что T6SS строится путем иерархического добавления TssK и TssFG.В качестве альтернативы полные базовые пластины могут быть собраны до стыковки с мембранным комплексом (рис. 7). В самом деле, подобная базисной пластинке структура прикреплена к внутренней мембране сетью взаимодействий, включая контакты между TssK и TssL, TssK и TssM, а также TssG и TssM ([40] и это исследование). Можно предположить, что TssK рекрутируется в комплекс TssJLM, а затем взаимодействие между базовой пластинчатой ​​структурой и мембранным комплексом стабилизируется за счет дополнительных контактов между TssM и комплексом TssFG. Этот путь сборки подтверждается записями флуоресцентной микроскопии, демонстрирующими, что TssF не рекрутируется в аппарат в отсутствие TssK или TssM, и что TssK не рекрутируется в аппарат в отсутствие TssM (Fig. 6). Интересно, что в отсутствие TssM, TssF-содержащие комплексы (базовые пластины?) собираются, хотя и на значительно более низких уровнях, указывая на то, что эти комплексы стабилизируются мембранным комплексом. TssM-независимая сборка этих комплексов, содержащих TssF, согласуется с наблюдениями, что (i) мембрана T6SS и комплексы базальная пластинка/хвост имеют различную эволюционную историю [2] и (ii) что мембранный комплекс не требуется для правильной сборки Трубки HCP (рис. 1C).Поразительно, но базовые пластинки фагов демонстрируют 6-кратную симметрию [22,29], и можно предположить, что идентичная симметрия применима к базовым пластинкам T6SS. Однако недавно было показано, что мембранный комплекс T6SS обладает 5-кратной симметрией [15]. Понимание того, как структура 6-кратной симметрии успешно и функционально связывается с док-станцией 5-кратной симметрии, еще предстоит выяснить. Как только базовая пластина присоединена к комплексу TssJLM, может продолжаться полимеризация внутренней трубки Hcp/внешней оболочки TssBC (рис. 7).Действительно, исследования взаимодействия показали, что TssF и TssG связаны с Hcp и TssC и могут инициировать удлинение хвоста. Данные, сообщающие о специфической роли TssA во время биогенеза T6SS, будут опубликованы в другом месте (Zoued, Durand et al. ., в процессе подготовки). Пространственно-временное рекрутирование TssE и VgrG во время пути сборки T6SS и их вклад в структуру базовой пластинки T6SS еще не известны и потребуют дальнейших исследований. У сократительных хвостатых бактериофагов базовая пластинка служит сборочной платформой для полимеризации трубки/оболочки и запускает сокращение оболочки путем передачи конформационных изменений от волокон при посадке на клетки-хозяева.Будет важно определить вклад базовой пластинки T6SS в контроль динамики оболочки T6SS при контакте с клетками-жертвами.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы, среда, условия роста и химикаты

Escherichia coli K-12 DH5α использовали для процедур клонирования, W3110 для совместной иммунопреципитации и BTh201 для бактериального двухгибридного анализа. Энтероагрегат E . Для этого исследования использовали coli штамм 17-2.Штаммы обычно выращивали в LB-бульоне при 37°C с аэрацией. Для индукции кластера генов sci-1 T6SS клетки выращивали в среде, индуцирующей Sci-1 (SIM: минимальная среда M9 с добавлением глицерина (0,2%), витамина B1 (1 мкг/мл), казаминокислот (40 мкг /мл), LB (10% v/v)) [49]. Плазмиды и мутации поддерживали добавлением ампициллина (100 мкг/мл для К-12, 200 мкг/мл для EAEC), канамицина (50 мкг/мл для К-12, 50 мкг/мл для хромосомной вставки на EAEC, 100 мкг/мл). мкг/мл для несущих плазмиду EAEC) или хлорамфеникол (40 мкг/мл).L-арабинозу приобретали у Sigma-Aldrich, ангидротетрациклин (АГТ – использовали в концентрации 0,2 мкг/мл на протяжении всего исследования) у IBA. Штаммы, плазмиды и олигонуклеотиды, используемые в этом исследовании, перечислены в таблице S1.

Штаммовая конструкция

Мутантные штаммы

Δ tss были сконструированы с использованием модифицированной одностадийной процедуры инактивации [50] с использованием красной рекомбиназы, экспрессируемой из pKOBEG [51], как описано ранее [52]. Кассету канамицина из pKD4 [50] амплифицировали с олигонуклеотидами, несущими 50-нуклеотидные удлинения, гомологичные участкам, примыкающим к гену-мишени.Продукт полимеразной цепной реакции (ПЦР) очищали на колонке (Promega PCR и Gel Cleanup) и подвергали электропорации. Были восстановлены клоны, устойчивые к канамицину, и вставка кассеты с канамицином в целевом сайте была подтверждена с помощью ПЦР. Затем канамициновую кассету вырезали с использованием плазмиды pCP20 [50] и конечный штамм проверяли с помощью ПЦР. Штамм Δ sci-1 с делецией, который содержит делецию фрагмента tssB-tssE ( i , e , все гены T6SS), конструировали аналогичным образом.Хромосомные флуоресцентные репортерные вставки получали по той же методике с использованием pKD4- gfp , p gfp -KD4 и p mCh -pKD4 в качестве матриц для ПЦР-амплификации.

Плазмидные конструкции

ПЦР проводили на термоциклере Biometra с использованием ДНК-полимеразы Pfu Turbo (Stratagene; La Jolla, CA). Индивидуальные олигонуклеотиды были синтезированы компанией Eurogentec. Конструкции pOK-Hcp _HA и pUC-Hcp _FLAG и их производных были описаны ранее [18,52].pTssF-HA был сконструирован путем встраивания ПЦР-фрагмента Eco RI- Xho I в pMS600, расщепленную теми же ферментами. Все остальные плазмиды были сконструированы методом безрестрикционного клонирования [53]: интересующий ген амплифицировали с олигонуклеотидами, несущими 5′-удлинения, отжиг с вектором-мишенью. Затем продукт первой ПЦР использовали в качестве олигонуклеотидов для второй ПЦР с использованием вектора-мишени в качестве матрицы. Все конструкции были проверены секвенированием ДНК (MWG).

Анализ сшивания Hcp

Анализ перекрестного связывания дисульфида in vivo проводили, как описано ранее [18].

Бактериальный двухгибридный анализ

Мы использовали двухгибридный метод на основе аденилатциклазы, используя ранее опубликованные протоколы [40, 54, 55]. Вкратце, пары тестируемых белков сливали с двумя каталитическими доменами Т18 и Т25 аденилатциклазы Bordetella . После совместной трансформации штамма BTh201 двумя плазмидами, продуцирующими слитые белки, планшеты инкубировали при 30°С в течение 2 дней.Независимыми колониями инокулировали 600 мкл среды LB с добавлением ампициллина, канамицина и 0,5 мМ изопропилтиогалактозида (ИПТГ). Клетки выращивали при 30°C в течение ночи и высевали на чашки с агаром LB с добавлением ампициллина, канамицина, IPTG (0,2 мМ) и 5-бром-4-хлор-3-индолил-D-галактопиранозида (X-Gal), хромогенного субстрата. -галактозидазы.

Ко-иммунопреципитация

10 ¹¹ экспоненциально растущие клетки, продуцирующие представляющие интерес белки, собирали и ресуспендировали в 20 мМ Tris-HCl (pH 8.0), NaCl 100 мМ с добавлением ингибиторов протеазы (Complete, Roche) и разделены тремя пассажами во Френч-прессе (1000 фунтов на кв. дюйм). Общий клеточный экстракт подвергали ультрацентрифугированию в течение 45 мин при 20 000 × г для удаления нерастворимого материала. Затем супернатанты инкубировали в течение ночи при 4°C с аффинными шариками против FLAG M2 (Sigma Aldrich) или с шариками с протеином G-агарозой (Roche), связанными с антителом против VSVG. Затем гранулы трижды промывали Трис-HCl 20 мМ (рН 8,0), NaCl 100 мМ.Общий экстракт и иммунопреципитированный материал ресуспендировали в загрузочном буфере Лэммли перед анализом с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга. Для экспериментов по восстановлению клеточные лизаты перемешивали в течение 30 мин. при 28°C до иммунного преципитации.

Анализ высвобождения Hcp, градиенты плотности фракционирования и седиментации

Анализ высвобождения

Hcp, фракционирование, дифференциальную солюбилизацию SLS, прерывистое осаждение, градиенты сахарозы и измерения активности NADH-оксидазы выполняли, как описано ранее [13].

Покадровая флуоресцентная микроскопия

Ночные культуры энтероагрегантов E . Штаммы производных coli 17–2 разбавляли 1:100 в среде SIM и выращивали в течение 6 часов до OD _{600 нм} ~ 1,0 для максимизации экспрессии кластера генов sci-1 T6SS, который активируется в железе- истощенных условиях [49]. Клетки промывали в фосфатно-солевом буфере (PBS), ресуспендировали в PBS до OD _{600 нм} ~ 50 и наносили на тонкий слой 1.5% агарозы в PBS и накрыли покровным стеклом. Записи микроскопии и цифровая обработка изображений выполнялись, как описано ранее [9,15,18,40]. Для статистического анализа флуоресцентные очаги обнаруживались автоматически. Во-первых, шум и фон были уменьшены с помощью плагина «Subtract Background» (20 пикселей Rolling Ball) от Fiji [56]. Очаги sfGFP были автоматически обнаружены с помощью простой обработки изображения: (1) создать маску клеточной поверхности и расширить (2) обнаружить отдельные клетки с помощью плагина «Анализ частиц» Фиджи (3) очаги sfGFP были идентифицированы с помощью «Найти Максима» на Фиджи [56].Чтобы избежать ложных срабатываний, каждое событие в исходных необработанных данных контролировалось вручную. Представление числа очагов на клетку в виде коробочек и усов было выполнено с помощью программного обеспечения R. Для отслеживания с субпиксельным разрешением флуоресцентные очаги обнаруживались с использованием алгоритма обнаружения максимумов локального и субпиксельного разрешения и отслеживались с течением времени с помощью специально разработанного плагина для ImageJ [56]. Координаты x и y были получены для каждого флуоресцентного фокуса на каждом кадре. Среднеквадратичное смещение рассчитывали как расстояние от фокусов до их положения в точке t ₀ в каждый момент времени с использованием программного обеспечения R и наносили на график во времени.Для каждого испытанного штамма рассчитывали среднеквадратичное смещение не менее десяти отдельных траекторий фокусировки. Кимограммы были получены после вычитания и секционирования фоновой флуоресценции с помощью плагина Kymoreslicewide под Fiji [56].

Стабильность стационарных уровней белка

Стабильность белка оценивали, как описано ранее [57]. Экспоненциально растущие клетки, продуцирующие TssF, TssG или как TssF, так и TssG, обрабатывали хлорамфениколом (40 мкг/мл) и спектиномицином (200 мкг/мл).Эквивалентные образцы OD собирали через 0, 5, 15, 30, 60, 120, 240, 480 и 960 минут после остановки синтеза белка, ресуспендировали в загрузочном буфере перед анализом с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Плотность бактерий (OD _{600 нм} ) измеряли на протяжении всего эксперимента, чтобы убедиться в отсутствии роста.

Разное

Белки, суспендированные в загрузочном буфере, подвергали SDS-PAGE. Для выявления иммуноокрашиванием белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны, а иммуноблоты зондировали первичными антителами и козьими вторичными антителами, связанными со щелочной фосфатазой, и проявляли в щелочном буфере в присутствии 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата и нитросинего. тетразолий.Поликлональные антитела анти-TolA, -TolB, -Pal и -OmpA взяты из нашей лабораторной коллекции. Анти-FLAG (Sigma-Aldrich), анти-VSV-G (Sigma-Aldrich), анти-HA (Roche), анти-EFTu (Hycult Biotech) и антикроличья, мышиная или крысиная щелочная фосфатаза, конъюгированная с козьим вторичным антитела (Beckman Coulter) были приобретены в соответствии с указаниями и использованы в соответствии с рекомендациями производителя.

Вспомогательная информация

S1 Рис. Белки TssF и TssG необходимы для секреции типа VI.

Влияние мутаций tssF и tssG на образование оболочки T6SS (A) и высвобождение белка Hcp (B).(A) Покадровые записи флуоресценции клеток WT, tssF или tssG , несущих слияние хромосом tssB-mCherry в исходном локусе. Отдельные изображения делались каждые 30 секунд. События сборки и сжатия/разборки обозначены черным и белым треугольниками соответственно. Шкала баров составляет 1 м. (B) Высвобождение Hcp _FLAG оценивали путем разделения фракций целых клеток (C) и супернатантов (S) от WT, tssF или tssG и дополненных tssF или tssG или цсГ ⁺ ) культур.В общей сложности 2×10 ⁸ клеток и ТХУ-преципитированный материал супернатанта из 5×10 ⁸ клеток наносили на SDS-PAGE с 12,5%-ным акриламидом и подвергали иммунодетекции с использованием моноклонального антитела против FLAG (нижняя панель). ) и поликлональные антитела против TolB (контроль целостности клеток; верхняя панель).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005545.s002

(TIF)

S2 Фиг. ClustalW выравнивание TssF и TssG с белком NP_7555275 из

E . кишечная палочка CFT073.

TssF и N-концевая область NP_7555275 имеют 58% идентичности и 75% сходства. TssG и С-концевая область NP_7555275 имеют 53% идентичности и 82% сходства. Область, соответствующая слиянию, обрамлена.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005545.s003

(TIF)

S3 Рис. Статистический анализ динамики и поведения флуоресцентных субъединиц.

Статистические анализы локализации _sfGFP ЦсФ (А), ЦсК _sfGFP (F) или _sfGFP ЦсМ (G) у указанных штаммов.Показаны графики измеренного количества _sfGFP TssF, TssK _sfGFP или _sfGFP TssM на клетку для каждого штамма с нижними и верхними границами прямоугольников, соответствующими 25% и 75% процентили соответственно. Черная жирная горизонтальная полоса представляет средние значения для каждого штамма, а усы представляют 10% и 90% процентили. Выбросы показаны незаштрихованными кружками. n указывает количество проанализированных клеток на штамм.(Б) Очаги _sfGFP TssF и TssK _sfGFP стабильны и статичны. Среднеквадратичное смещение (в пикселях) _{кластеров sfGFP} TssF в клетках WT (синий график) или Δ tssBC клеток (красный график) и кластеров TssKsfGFP в клетках WT (черный график) измеряли путем субпиксельного отслеживания флуоресцентных фокусов и график по времени (в минутах). (C) Кластеры _sfGFP TssF собираются до оболочек TssBC. Кинетика появления кластеров _sfGFP TssF (зеленая линия) и динамика оболочек TssB _mCh (столбцы; оранжевый: удлинение, синий: удлинение; фиолетовый: сжатие/разборка) в зависимости от времени (в минутах).(D) _sfGFP TssF остается в основании чехла при растяжении. Кимографический анализ показывает положение _sfGFP TssF (зеленый) и TssB _mCh (красный) внутри клетки в зависимости от времени. (E) Процент чехлов (обозначенных как удлиненные структуры TssB _mCh ) с базальными кластерами _sfGFP TssF (обозначенных фокусами, меченными GFP) (пунктирная полоса) в штамме, продуцирующем как _sfGFP TssF, так и TssB _{mCh . n указывает количество проанализированных клеток.}

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005545.s004

(TIFF)

S4 Рис. Сравнение взаимодействия субъединиц T6SS и T4 бактериофага.

Схематическое представление известных взаимодействий между выбранными компонентами бактериофага T4 (вверху) или между компонентами T6SS (внизу). Белки с общей последовательностью или структурной гомологией обозначены одним цветом. Компоненты клина бактериофага T4 указаны в синей рамке, а мембранный комплекс T6SS (MC), комплекс базовой пластины (BC) и хвостовой комплекс (TC) выделены серым, зеленым и красным цветом соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005545.s005

(TIF)

Благодарности

Мы посвящаем эту работу Арлетт Дарфёй-Мишо в память о ней [58]. Мы благодарим членов исследовательских групп Cascales, Cambillau, Lloubes, Sturgis и Bouveret за полезные обсуждения, Emmanuelle Bouveret за бактериальные двухгибридные штаммы, векторы, протоколы и полезные обсуждения, Tâm Mignot за анализы кимографа и обсуждения флуоресцентной микроскопии, Laure Journet , Erwan Gueguen, Eric Durand, Roland Lloubes, Mireille Ansaldi, Bérengère Ize и Brigitte Meunier за плодотворные обсуждения и поддержку, Marthe Gavioli, Olivier Uderso, Isabelle Bringer и Annick Brun за техническую помощь и Thomas Toquette-Schoepp за поддержку.

Авторские взносы

Идея и разработка экспериментов: YRB AZ EC. Выполнены опыты: YRB AZ FB BD. Проанализированы данные: YRB AZ FB EC. Предоставленные реагенты/материалы/инструменты для анализа: FB EC. Написал статью: YRB AZ EC.

Каталожные номера

1. 1.
   Рассел А.Б., Петерсон С.Б., Мугус Д.Д. (2014) Эффекторы системы секреции типа VI: целенаправленные яды. Nat Rev Microbiol. 12: 137–48. пмид:24384601
2. 2.
   Boyer F, Fichant G, Berthod J, Vandenbrouck Y, Attree I (2009) Анализ системы секреции бактерий типа VI с помощью полногеномного анализа in silico: что можно узнать из доступных микробных геномных ресурсов? Геномика BMC.10:104. пмид:19284603
3. 3.
   Coulthurst SJ (2013) Система секреции типа VI — широко распространенная и универсальная система нацеливания на клетки. Рез микробиол. 164: 640–54. пмид:23542428
4. 4.
   Borgeaud S, Metzger LC, Scrignari T, Blokesch M (2015) Система секреции Vibrio cholerae типа VI способствует горизонтальному переносу генов. Наука. 347:63–7. пмид:25554784
5. 5.
   Benz J, Meinhart A (2014)Антибактериальные эффекторные/иммунные системы: это лишь верхушка айсберга.Curr Opin Microbiol. 17: 1–10. пмид:24581686
6. 6.
   Durand E, Cambillau C, Cascales E, Journet L (2014) VgrG, Tae, Tle и другие: универсальный арсенал эффекторов секреции типа VI. Тенденции микробиол. 22: 498–507. пмид:25042941
7. 7.
   LeRoux M, De Leon JA, Kuwada NJ, Russell AB, Pinto-Santini D, et al. (2012)Количественная характеристика бактериальных взаимодействий с отдельными клетками показывает, что секреция типа VI является палкой о двух концах. Proc Natl Acad Sci USA.109: 19804–9. пмид:23150540
8. 8.
   Basler M, Ho BT, Mekalanos JJ (2013)Око за око: контратака системы секреции типа VI во время взаимодействия бактериальных клеток. Клетка. 152: 884–94. пмид:23415234
9. 9.
   Brunet YR, Espinosa L, Harchouni S, Mignot T, Cascales E (2013) Визуализация уничтожения бактерий, опосредованного секрецией VI типа. Cell Rep. 3: 36–41. пмид:23291094
10. 10.
    Cascales E, Cambillau C (2012)Структурная биология систем секреции типа VI.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 367: 1102–11. пмид:22411981
11. 11.
    Хо Б.Т., Донг Т.Г., Мекаланос Дж.Дж. (2014) Взгляд на убийство: бактериальная система секреции типа VI. Клеточный микроб-хозяин. 15: 9–21. пмид:24332978
12. 12.
    Зуэд А., Брюнет Ю.Р., Дюран Э., Аштген М.С., Логгер Л. и соавт. (2014)Архитектура и сборка системы секреции типа VI. Биохим Биофиз Акта. 1843: 1664–73. пмид:24681160
13. 13.
    Аштген М.С., Гавиоли М., Дессен А., Ллубес Р., Каскалес Э. (2010)Белок SciZ закрепляет энтероагрегативную систему секреции Escherichia coli типа VI на клеточной стенке.Мол микробиол. 75:886–99. пмид:20487285
14. 14.
    Felisberto-Rodrigues C, Durand E, Aschtgen MS, Blangy S, Ortiz-Lombardia M, et al. (2011) На пути к структурному пониманию систем секреции бактерий типа VI: характеристика комплекса TssJ-TssM патовара Escherichia coli. PLoS Патог. 7: e1002386. пмид:22102820
15. 15.
    Дюран Э., Нгуен В.С., Зуэд А., Логгер Л., Пехау-Арноде Г. и др. (2015)Биогенез и структура основного комплекса секреторной мембраны типа VI.Природа. 523: 555–560. пмид:26200339
16. 16.
    Лейман П. Г., Баслер М., Рамагопал Ю.А., Бонанно Дж.Б., Саудер Дж.М. и др. (2009) Аппарат секреции типа VI и белковые комплексы, связанные с фаговым хвостом, имеют общее эволюционное происхождение. Proc Natl Acad Sci USA. 106: 4154–9. пмид:19251641
17. 17.
    Баллистер Э.Р., Лай А.Х., Цукерманн Р.Н., Ченг Ю., Мугус Д.Д. (2008) Самосборка адаптируемых нанотрубок in vitro из простого строительного блока белка. Proc Natl Acad Sci USA.105:3733–8. пмид:18310321
18. 18.
    Brunet YR, Hénin J, Celia H, Cascales E (2014) Секреция типа VI и хвостовые трубки бактериофагов имеют общий путь сборки. EMBO Rep. 15: 315–21. пмид:24488256
19. 19.
    Shneider MM, Buth SA, Ho BT, Basler M, Mekalanos JJ, et al. (2013) Белки с повторами PAAR обостряют и диверсифицируют спайк системы секреции типа VI. Природа. 500: 350–3. пмид:23925114
20. 20.
    Канамару С. (2009)Структурное сходство хвостатых фагов и систем секреции патогенных бактерий.Proc Natl Acad Sci USA. 106: 4067–8. пмид:19276114
21. 21.
    Бенеманн Г., Пьетросюк А., Могк А. (2010) Трубочки и пончики: история секреции типа VI. Мол микробиол. 76:815–21. пмид:20444095
22. 22.
    Лейман П.Г., Шнейдер М.М. (2012) Сократительные хвостовые аппараты бактериофагов. Adv Exp Med Biol. 726: 93–114. пмид:22297511
23. 23.
    Кубе С., Капитеин Н., Зимняк Т., Херцог Ф., Могк А. и др. (2014)Структура секреторного комплекса VipA/B типа VI предполагает механизм рециркуляции, специфичный для состояния сокращения.Ячейка 8: 20–30. пмид:24953649
24. 24.
    Клеменс Д.Л., Гэ П., Ли Б.Я., Хорвиц М.А., Чжоу Чж. (2015) Атомная структура T6SS показывает чересстрочный массив, необходимый для функционирования. Клетка. 160: 940–951. пмид:25723168
25. 25.
    Кудряшев М., Ван Р.Ю., Бракманн М., Шерер С., Майер Т. и соавт. (2015)Структура сократительной оболочки системы секреции VI типа. Клетка. 160: 952–962. пмид:25723169
26. 26.
    Basler M, Pilhofer M, Henderson GP, ​​Jensen GJ, Mekalanos JJ (2012) Секреция типа VI требует динамической сократительной структуры, подобной хвосту фага. Природа. 483: 182–6. пмид:22367545
27. 27.
    Капитейн Н., Бенеманн Г., Петросюк А., Сейффер Ф., Хауссер И. и др. (2013). ClpV рециркулирует канальцы VipA/VipB и предотвращает образование непродуктивных канальцев, чтобы обеспечить эффективную секрецию белка типа VI. Мол микробиол. 87: 1013–28. пмид:23289512
28. 28.
    Капитеин Н., Могк А. (2013)Смертельные шприцы: активность системы секреции типа VI в патогенности и межбактериальной конкуренции. Curr Opin Microbiol. 16: 52–8. пмид:232
29. 29.Костюченко В.А., Лейман П.Г., Чипман П.Р., Канамару С., ван Раай М.Дж. и др. (2003) Трехмерная структура базовой пластинки бактериофага Т4. Nat Struct Biol. 10: 688–93. пмид:12923574
30. 30.
    Костюченко В.А., Чипман П.Р., Лейман П.Г., Арисака Ф., Месянжинов В.В., и др. (2005)Структура хвоста бактериофага Т4 и механизм его сокращения. Nat Struct Mol Biol. 12: 810–3. пмид:16116440
31. 31.
    Лейман П.Г., Арисака Ф., ван Раай М. Дж., Костюченко В.А., Аксюк А.А., и соавт.(2010)Морфогенез хвоста Т4 и хвостовых волокон. Вирол Дж. 7: 355. pmid:21129200
32. 32.
    Хаггард-Льюнгквист Э., Якобсен Э., Ришовд С., Сикс Э.В., Нильссен О. и др. (1995) Бактериофаг P2: гены, участвующие в сборке базовой пластины. Вирусология. 213: 109–21. пмид:7483254
33. 33.
    Хаузер Р., Блаше С., Докланд Т., Хаггорд-Льюнгквист Э., фон Брунн А. и др. (2012) Белково-белковые взаимодействия бактериофагов. Adv вирус Res. 83: 219–98. пмид:22748812
34. 34.
    King J (1968)Сборка хвоста бактериофага Т4.Дж Мол Биол. 32: 231–62. пмид:4868421
35. 35.
    Bingle LE, Bailey CM, Pallen MJ (2008) Секреция типа VI: руководство для начинающих. Curr Opin Microbiol. 11: 3–8. пмид:18289922
36. 36.
    Cascales E (2008) Набор инструментов для секреции типа VI. EMBO Rep. 9: 735–41. пмид:18617888
37. 37.
    Silverman JM, Brunet YR, Cascales E, Mougous JD (2012)Структура и регуляция системы секреции типа VI. Анну Рев Микробиол. 66: 453–72. пмид:22746332
38. 38.Lossi NS, Dajani R, Freemont P, Filloux A (2011) Структурно-функциональный анализ HsiF, gp25-подобного компонента системы секреции типа VI, у Pseudomonas aeruginosa. Микробиология. 157: 3292–305. пмид: 21873404
39. 39.
    Яп М.Л., Мио К., Лейман П.Г., Канамару С., Арисака Ф. (2010)Клинья базовой пластины бактериофага Т4 спонтанно собираются в структуру, подобную базовой пластине без выступов, in vitro. Дж Мол Биол. 395: 349–60. пмид:19896486
40. 40.
    Zoued A, Durand E, Bebeacua C, Brunet YR, Douzi B, et al.(2013) TssK представляет собой тримерный цитоплазматический белок, взаимодействующий с компонентами как фагоподобных, так и мембранно-якорных комплексов системы секреции VI типа. Дж. Биол. Хим. 288: 27031–41. пмид:23921384
41. 41.
    Сёдинг Дж., Бигерт А., Лупас А.Н. (2005) Интерактивный сервер HHpred для обнаружения гомологии белков и прогнозирования структуры. Нуклеиновые Кислоты Res. 33: W244–8. пмид:15980461
42. 42.
    Ямасита Э., Накагава А., Такахаши Дж., Цунода К., Ямада С. и др. (2011)Связывающий хозяин домен хвостового шипа фага P2 обнаруживает тримерную железосвязывающую структуру.Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 67: 837–41. пмид:21821878
43. 43.
    Kikuchi Y, King J (1975)Генетический контроль морфогенеза базовой пластинки бактериофага T4. II. Мутанты не могут сформировать центральную часть базовой пластины. Дж Мол Биол. 99: 673–94. пмид:765482
44. 44.
    Kikuchi Y, King J (1975)Генетический контроль морфогенеза базовой пластинки бактериофага T4. III. Формирование центральной пробки и общего пути сборки. Дж Мол Биол. 99: 695–716. пмид:765483
45. 45.Watts NR, Coombs DH (1989) Анализ ближних контактов в клиньях бактериофага T4 и базовых пластинах без выступов с использованием расщепляемого химического сшивающего агента. Дж Вирол. 63: 2427–36. пмид:2724408
46. 46.
    English G, Byron O, Cianfanelli FR, Prescott AR, Coulthurst SJ (2014) Биохимический анализ TssK, основного компонента бактериальной системы секреции типа VI, выявляет различные олигомерные состояния TssK и идентифицирует субкомплекс TssK-TssFG. Биохим Дж. 461: 291–304.пмид:24779861
47. 47.
    Sarris PF, Ladoukakis ED, Panopoulos NJ, Scoulica EV (2014)Элемент, происходящий из фагового хвоста, с широким распространением среди обоих прокариотических доменов: сравнительное геномное и филогенетическое исследование. Геном Биол Эвол. 6: 1739–1747. пмид:25015235
48. 48.
    Аксюк А.А., Лейман П.Г., Шнейдер М.М., Месянжинов В.В., Россманн М.Г. (2009) Структура продукта гена 6 бактериофага Т4, шарнирного стержня базовой пластинки. Структура. 17: 800–8. пмид:19523898
49. 49.Brunet YR, Bernard CS, Gavioli M, Lloubès R, Cascales E (2011)Эпигенетический переключатель, включающий перекрывающееся метилирование меха и ДНК, оптимизирует экспрессию кластера генов секреции VI типа. Генетика PLoS. 7:e1002205. пмид:21829382
50. 50.
    Даценко К.А., Ваннер Б.Л. (2000) Одностадийная инактивация хромосомных генов у Escherichia coli K-12 с использованием продуктов ПЦР. Proc Natl Acad Sci USA. 97: 6640–5. пмид:10829079
51. 51.
    Chaveroche MK, Ghigo JM, d’Enfert C (2000)Быстрый метод эффективной замены генов в нитчатом грибе Aspergillus nidulans.Нуклеиновые Кислоты Res. 28: Е97. пмид:11071951
52. 52.
    Aschtgen MS, Bernard CS, De Bentzmann S, Lloubès R, Cascales E (2008) SciN представляет собой липопротеин внешней мембраны, необходимый для секреции типа VI в энтероагрегативной кишечной палочке. J Бактериол. 190: 7523–31. пмид:18805985
53. 53.
    van den Ent F, Löwe J (2006) RF-клонирование: метод без ограничений для вставки генов-мишеней в плазмиды. J Biochem Биофизические методы. 67: 67–74. пмид:16480772
54. 54.Каримова Г., Пиду Дж., Ульманн А., Ладан Д. (1998) Бактериальная двухгибридная система, основанная на восстановленном пути передачи сигнала. Proc Natl Acad Sci USA. 95: 5752-6. пмид:9576956
55. 55.
    Battesti A, Bouveret E (2012)Бактериальная двухгибридная система, основанная на восстановлении аденилатциклазы в Escherichia coli. Методы. 58: 325–34. пмид:22841567
56. 56.
    Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frize E, Kaynig V, Longair M, et al. (2012) Фиджи: платформа с открытым исходным кодом для анализа биологических изображений.Нат Методы. 9: 676–682. пмид:22743772
57. 57.
    Cascales E, Lloubès R, Sturgis JN (2001) Белки TolQ-TolR активизируют TolA и обладают гомологией с жгутиковыми моторными белками MotA-MotB. Мол микробиол. 42: 795–807. пмид:11722743
58. 58.
    Райш Дж., Сивиньон А., Шассинг Б., Лапакет П., Микель С. и др. (2014) Арлетт Дарфей-Мишо: исследователь, лектор, лидер, наставник и друг. Гастроэнтерология 147: 943–944. пмид:25438798
59. 59.
    Гальперин М.Ю., Макарова К.С., Вольф Ю.И., Кунин Е.В. (2015)Расширенный охват микробного генома и улучшенная аннотация семейства белков в базе данных COG.Нуклеиновые Кислоты Res. 43: Д261–9. пмид: 25428365