Мангал чертеж складной: Складной мангал своими руками: чертежи, фото

Содержание

Складной мангал своими руками. Чертежи мангалов из металла

Чтобы изготовить своими руками простой мангал из металла чертежи, пожалуй, не нужны. Достаточно определиться с размерами, вырезать из металла пять прямоугольных заготовок, сварить их вместе, а снизу приварить четыре уголка в качестве ножек.

Вот и всё. Получится, возможно, не особо аккуратно, но вполне функционально – шашлыки пожарить можно. Но в багажник автомобиля вы такой мангал вряд ли захотите засовывать, а потому судьба у него невесёлая: прожить всю свою жизнь на одном месте, максимум – иногда перемещаться с одного угла дачного участка на другой.

Если иногда хочется качественно приготовленного шашлычка на природе вдали от города, то придется купить или сделать складной мангал своими руками — но без чертежей в этом случае уже никуда.

Насчёт «купить»…
Я с уважением отношусь к изделиям, продающимся под торговой маркой Forester, среди них есть немало достойных аксессуаров для отдыха и туризма. Но их разборные мангалы (на фото в начале статьи) – это, простите, одноразовое убожество, основное и единственное достоинство которого – сравнительно низкая цена. Собственно, я вообще практически не встречал в продаже нормальных разборных или складных мангалов. Следовательно, выход остается только один: сделать складной мангал своими руками.

Мои чертежи мангалов из металла

Складные мангалы из металла, чертежи которых я вам предлагаю, довольно сложны в изготовлении, но зато на выходе вы получаете достойный мангал, который будет служить вам долгие годы и на даче, и при выездах на природу.

Если со сварным мангалом из металла можно обойтись болгаркой, то качественный складной мангал своими руками «на коленке» сделать проблематично: потребуется обрубочное и листогибочное оборудование. У меня с этим проблем нет, ну а вы можете отдать заказ на изготовление складного мангала по своим чертежам на какой-нибудь завод металлоизделий.
С этим проблем сейчас, как правило, не возникает.

Чертежи мангалов из металла достаточно подробные и в особых пояснениях, думаю, не нуждаются.
Единственное: для стенок используется металл толщиной не менее 2мм, а дно делайте из металла 3.5-4 мм толщиной. Если удастся сделать складной мангал из нержавеющей стали – совсем хорошо, да и металл можно брать на полмиллиметра тоньше.

Чертежи мангалов кликабельны. Нажимайте на картинку для увеличения.

Складной мангал. Чертеж №1

Складной мангал. Чертеж №2

Складной мангал. Чертеж №3

Складной мангал — это хорошо, но он у меня является лишь дополнением к стационарной печи-мангалу, которую я построил на дачном участке. Статья о том, как построить уличную печь-мангал содержит описание, чертежи и порядовку. Дерзайте!

Ну, и на десерт: вот вам инструкция, как приготовить по-настоящему правильный шашлык.

Чертеж мангала из металла с размерами, фото

Вряд ли любители отдохнуть на природе будут делать это без приготовления шашлыка. Чтобы приготовление было приятным, а готовый продукт имел восхитительный вкус, нужен как минимум нормальный мангал из металла, ну и, конечно же, опыт в приготовлении лакомства. Если обдув происходит только с помощью ветра, угли будут разгораться неравномерно, жар получится не очень качественным. Шашлык может с одной стороны пригореть, или не дожариться. Не совсем удобно на отдых брать громоздкое изделие. Оптимальным вариантом, если планируется выезд на природу, будет складной мангал.

Вариантов того, как сделать мангал из металла своими руками, может быть несколько. Если планируется не покупать, а изготовить все собственноручно, придется приложить немного усилий. Но сделать что-то своими руками, после чего многократно восхищаться удобством и качеством изготовления – это неоспоримые преимущества, которые заставят домашнего мастера немедленно приступить к изготовлению.

Складной мангал обладает несколькими преимуществами перед обычным аналогом:

  • его можно переносить в другое место не опасаясь, что руки будут испачканы в саже;
  • мобильность конструкции максимальная: он легко поместится в кузов автомобиля, в отличие от стационарного;
  • обеспечивается легкость мытья, разборки изделия.

Изготовление складного металлического мангала своими руками

Перед нарезкой железа и другими действиями требуется составление чертежа изделия. Можно пользоваться уже готовыми вариантами, но, если хочется построить что-то оригинальное, некоторые цифры в предложенных данных можно изменять по своему усмотрению. Чертеж делать несложно, но должна быть предусмотрена каждая деталь.

Чтобы переносной мангал легко разбирался, переносился, он должен состоять из нескольких обязательных частей. Они делаются не очень большими, чтобы, разобрав изделие, его можно было легко перемещать.

После разбора и приготовления чертежей стоит продумать, как он будет перевозиться. Для перевозки можно использовать маленький старый чемодан, дипломат. Некоторые используют сумку, или даже маленький деревянный ящик. Каркас, в котором мангал будет перемещаться, должен не сильно отличаться размерами от самого изделия. Как вариант, можно подогнать размеры самого мангала на чертежах, если имеется уже готовый каркас для его перевозки.
Вариант схемы мангала

Стоит знать, как сделать разборный мангал своими руками, но, кроме этого, учесть множество мелочей. Кроме самого изделия, придется перевозить шампура, некоторые предпочитают решетку для гриля. Угли обычно находятся в специальном пакете. Плюс, мясо, посуда, другие дополнительные приспособления. Смысл в том, что чем меньше будет занимать места жаровня, тем лучше.

Если планируется перевозить мангал только в машине, а руками перемещать его придется минимально, длина может быть значительно увеличена. Некоторые делают ее до метра, и это вполне удобно, если продумать все мелочи, связанные с перемещением конструкции.

Схема мангала

Не стоит делать барбекю меньше 60 (по длине) х 30 (по ширине) х 15 (по высоте). Размеры минимальны для помещения туда шести шампуров. Если сделать меньше, в один прекрасный момент может возникнуть неудобство, нехватка места для приготовления мяса. Делать следует из металла, который соответствует следующим требованиям:

  1. Должен быть легким, прочным.
  2. Не должен покрываться ржавчиной, на нем не должны оставаться следы коррозии.
  3. Температура плавления должна быть высокой.
  4. Материал не должен быть токсичным.

Подойдет простая нержавеющая сталь, потому что ее характеристики вполне отвечают заявленным требованиям. Толщину листов можно выбирать в 2-3 мм. Материалы тоньше 2 мм будут со временем деформироваться. При повышении толщины конструкция будет слишком тяжелой. Днище будет нагреваться и подвергаться высокой температуре чаще остальных граней. Имеет смысл сделать его 5 мм толщиной. Если такого материала нет, можно воспользоваться листовым железом, сплавами тугоплавких металлов.

Процесс изготовления мангала

Раскладные конструкции получаются не всегда правильно. Чтобы все получилось нормально, следует перенести с чертежа цифры на металл и вырезать необходимые части. Например, если размеры составляют 60х30х15 см на чертеже, на металле получится так:

  • 2 части, располагающиеся с боков, размерами 60х15 см;
  • 2 части, размеры которых 30х15 см;
  • дно, размер которого 60х30 см.

Мангалы своими руками из нержавейки

Стоит продумать, как будут делаться ножки. Некоторые делают их отдельно, можно сделать их продолжением днища или торцевых граней. Для удобства ножки делаются высотой чуть менее метра, чтобы готовое изделие было по высоте около 100 – 120 см. До начала изготовления стоит продумать, какие дополнительные части придется устанавливать в мангал. Например, крепления, которые можно изготовить в форме уголков или навесов (как в форточках). Оно привариваются к основанию корпуса.

Если сварочный аппарат отсутствует, не критично сделать все части составными, то есть так, чтобы они вставлялись одна в другую. На чертеже делается несколько выступов, которые формой будут как буква «Г». Их размеры составляют около 1,5х3 см. На торцах в схеме делаются места, где будут проделаны распилы. Там ставятся крепления. Такие же крепления можно делать, чтобы зафиксировать дно. После решения вопроса с креплениями можно приступать к вырезке частей мангала.

Готовые мангалы

Режется все с помощью болгарки. После вырезания все части обязательно должны шлифоваться. Заусенцы на краях должны быть обязательно убраны, так как об них легко порезаться. В боковых частях проделываются небольшие отверстия, которые послужат как ручки. Они понадобятся, если будет нужно переставить изделие с одного места на другое. Сделать складной мангал своими руками из металла, если чертежи имеются, не так сложно, как кажется – достаточно приложить немного усилий, понять технологию изготовления.

После шлифовки деталей внизу боковых стенок проделываются отверстия для вентиляции, подачи воздуха к углям. Делается 2 ряда, толщина каждого по 1 см. Для красоты проделывать их лучше всего в шахматном порядке. Расстояние между каждой составляет 4 см. Цифры примерны, здесь нет обязательного значения.
Пример мангала

Если ножки планируется делать съемными, на днище, в самых уголках, привариваются гайки или уголки, в которые можно будет установить ножки. Стойки делаются из трубок или уголков. После приготовления всех частей их можно сваривать в единую конструкцию или соединять, если изделие планировалось выполнить без сварки.
Готовый мангал

Если в качестве материала использовалась нержавейка, его не нужно обрабатывать составами против коррозии. В других случаях необходимо покрыть металл антикоррозийными составами. Защитить можно с помощью воронения или покраски. Стоит помнить, что человек, сделавший мангал сам, будет гордиться своим изделием. Особенно в случае, если у него не раз получилось сделать отменный шашлык.

на фото и видео в чемоданчике и складной

Складные и раскладные приспособления для приготовления шашлыков выручают в первую очередь при организации пикников на лоне дикой природы. Но и в дачных условиях можно сделать разборный мангал своими руками и использовать его по назначению в случае необходимости. Изготовленный по правилам разборный мангал из металла своими руками всегда отличается от покупной большей прочности и долговечностью. Так что стоит потратить совсем немного свободного времени для создания этой незаменимой в хозяйстве конструкции простейшего очага.

Далее можно посмотреть сделанные своими руками разборные мангалы на фото – это позволит понять, что они намного лучше покупных. Продемонстрирована аккуратная сборка и тщательный подбор всех деталей.

Складные мангалы своими руками (с фото)

Складные мангалы своими руками сделать можно из простых и доступных листов металла. Масса такого мангала составляет всего 2-2,5 кг. Для изготовления стенок и днища жаровни понадобится листовая сталь толщиной от 0,8 до 1,5 мм, для ножек — стальной пруток 5 мм. Кроме того, потребуются четыре гайки.

 

Для того чтобы изготовить складной мангал своими руками, потребуется стальной лист. Из него необходимо вырезать заготовки по размерам, указанным в чертежах. Затем полученные заготовки следует поочередно зажать в тисках и в указанных местах загнуть, просверлить отверстия для крепежа и вентиляции.

Перед тем как сделать складной мангал, нужно отпилить от прутка четыре заготовки для ножек, загнуть их с двух сторон и с одного конца нарезать резьбу.

 

После этого можно приступать к сборке мангала. Для этого боковой и торцевой листы необходимо совместить под углом 90° друг к другу таким образом, чтобы крепежные отверстия совпали. Затем ножку следует вставить в совпавшие отверстия и закрутить гайкой.

Аналогично нужно собрать боковой и торцевой листы, а затем уложить обе половинки днища таким образом, чтобы их ребра оказались посередине мангала и были обращены вниз.

На заметку! Полка представляет собой прямоугольник, вырезанный из металлического листа.

По углам его, так же как и у поддона мангала, необходимо просверлить отверстия, на которые полка будет надеваться на верхние концы ножек мангала.

При этом полка должна опуститься на необходимую высоту, ограничиваемую соответствующими изгибами концов ножек. Затем в ножки следует вставить ограничительные штифты и надеть на ножки поддон. После этого конструкция приобретет жесткость и устойчивость. Одновременно полка может служить своеобразным столиком, на котором удобно располагать все необходимое для жарки.

Посмотрите сделанные своими руками складные мангалы на фото, где можно почерпнуть массу интересных идей для творчества:

 

 

Раскладной-складной переносной мангал в чемодане своими руками

Благодаря особой конструкции переносной мангал в чемоданчике можно разбирать и собирать еще быстрее. Его корпус состоит из двух частей, верхней и нижней. Они являются основой всей конструкции.

 

Для того чтобы изготовить мангал чемодан своими руками потребуется лист железа (например, кровельного), из которого с помощью ножниц по металлу следует вырезать две выкройки. На них необходимо разметить линии сгиба и просверлить вентиляционные отверстия.

 

Затем обе заготовки поочередно нужно уложить на край верстака или стола, затем с помощью молотка согнуть их по намеченным линиям таким образом, чтобы получились корытца. Получившаяся заготовка, которая имеет перфорацию только по боковым стенкам, будет нижней частью мангала, т. е. поддоном.

 

На верхней кромке его передней стенки с помощью треугольного напильника или ножниц необходимо сформировать зубцы, в которые своей передней частью будут вставляться шампуры.

Полностью перфорированное корытце можно использовать в качестве вертикальной ветрозащитной задней стенки, нижний край которой отгибается таким образом, что становится опорой для других концов шампуров.

Для защиты от ветра из того же листа необходимо выкроить и вырезать две боковые заслонки. Внешне они представляют собой прямоугольные пластины, один из верхних углов у которых скруглен.

Монтаж заслонок для раскладного мангала чемодана своими руками следует проводить без дополнительной фиксации, но довольно плотно. Их нижняя часть должна упираться в поддон, а верхняя поджиматься козырьком ветрозащитной стенки.

Переносной мангал в чемоданчике

На заметку! Все заготовки для складного мангала в чемодане можно своими руками обеспечить дополнительными шарнирными соединениями (например, петлями). Существует и более простой способ крепления, при котором детали просто вставляются друг в друга.

 

В качестве опор для переносного мангала в чемоданчике можно использовать металлические трубки диаметром 10 мм, соединенные попарно посредине таким образом, чтобы в результате получились шарнирные Х-образные ножки. В качестве шарниров удобнее всего использовать болты с гайками-барашками, которые смогут обеспечить жесткое стягивание трубчатых пар и их дальнейшее легкое разъединение для транспортировки или хранения.

 

Для соединения ножек с мангалом не требуется особое крепление. Необходимо просто надеть поддон на верхние концы разведенных трубок. Для этого по углам поддона нужно просверлить соответствующие отверстия. Чтобы поддон не опускался, на концах трубок должны быть ограничительные штифты. Хотя внешне конструкция кажется хрупкой, мангал очень устойчив. Такая надежность достигается еще и благодаря вспомогательной полке.

Посмотрите, как сделать разборный мангал своими руками на видео, где показана технология и предложены советы опытных мастеров:

Разборный (складной) мангал своими руками

Поклонники энергичного отдыха на природе решаются выполнить разборный мангал собственными руками, исходя из того что промышленные модели бывают не удобные, не долговечные и непрочны.

Кусающейся оказуется и цена изделий, реализовываемых на рынке.

Имея умения отделки металла, сварочный аппарат и инструмент для работы (дрель, болгарка), приходит пора начать работать.

Специфики складного мангала

Делать складной мангал собственными руками советуют из лёгких сплавов, чтоб не утяжелять изделие.

Схемы и чертежи:

Оно должно очень легко и быстренько собираться, потом назад разбираться. В разборном виде любой из компонентов производится небольшим, чтоб вмещаться в дорожной сумочке, портфеле, багажнике или специализированном переносном дипломате.

Приступая к работе, следует приготовить чертеж разборного мангала из металла.

Можно применить готовые схемы или, имея многие технические умения, составить их самостоятельно. Внося каждые практичные перемены изделие будет становиться лучше и удобнее.

В собранном состоянии складной мангал в чемодане обязан собой представляет маленький ящик толщиной не больше 50 мм.

Вместе с ним можно носит шампура, блюдца, решеточку для гриля, бесчисленные маленькие предметы и все то, что понадобится на пикничке, укомплектовав настоящий комплект.

Чтоб сделать складной мангал в чемодане, нужно запастись листовым металлом.

Через чур тоненький быстренько изотрётся, через чур толстый – изделие будет тяжёлым. Имеет смысл сделать остановку на варианте толщиной 2-3 мм, днище можно вырезать из листочка 4-5 мм.

Видео-урок:

Какой протяжённости будет мангал складной в дипломате – каждый решает для себя.

Но на нем должны вмещаться от 6 до 10 шампуров, какие не будут один одному мешать. Ширина обязана позволять размещать около 7 кусочков мяса так, чтобы они не касались стенок.

Зачастую выполняют походный складной мангал следующих размеров:

  • Две полосы для главных стенок – 90х15 см;
  • Две полосы для боковых стенок – 30х15 см;
  • Она полоса для того чтобы – 90х30 см;
  • Трубки для ног протяжённостью 60-100 мм;
  • Уголочки.

Приступаем к работе

Чтоб сделать разборный мангал из нержавеющей стали, на железный листочек наносят разметку грядущих составляющих изделия.

С помощью болгарки выкраиваются все прямоугольники. Краешка нужно зашлифовать от заусенец.

Абсолютно любой, даже разборный мангал в чемодане, должен иметь дырочки для воздуха забора.

По низу длинных боковых стенок, приблизительно на два-три см выше краешка, сверлятся несколько отверстий диаметром 10-15 см с шажком около 5 см.

Между основанием и стенками крепят на каждую сторону по два мебельных завеса, чтоб рукодельный складной мангал смог собираться в небольшой ящик.

Их можно приварить электросваркой, но самыми оптимальными считаются винтовые соеденения.

Сейчас следует задуматься о ножках. К днищу привариваются гайки M8, в какие они будут вкручиваться.

Видео:

Для стоек применяют трубки диаметром 8 мм, с одной стороны каких вваривают шпильку с резьбой М8, вторую сторону заостряют.

Можно выполнить складной мангал из нержавеющей стали на ножках из уголочков. На вышине в 15-20 см от земли лучше приварить поперечины, какие будут являться упором и предупреждать заглубление в почву.

К боковым частям стоит прикрепить пару ручек, благодаря которым удобно будет переставливать изделие. Они обязаны быть подвижными и опять же складываться.

На одной из стен необходимо предусматривать крючок, чтоб разборный мангал дипломат из нержавеющей стали произвольно не раскрылся при переноске.

Когда возникает желание перестраховаться от скверных условий погоды, принимают решение выстроить разборный мангал с кровлей.

Но абсолютно любое, даже такой продукт без специализированной отделки очень долго не отслужит. Рассмотрим несколько вариантов его совершенствования.

Как обезопасить и сделать лучше изделие?

Первым делом рукодельный разборный мангал необходимо обезопасить от коррозии.

Одним из основных способов борьбы с ржавчиной как правило считается окраска готового изделия специализированными составами, какие могут выдержать влияние больших температур – до 700 градусов.

Можно применить фарбу, раздаваемую в аэрозольных баллонах и приготовленную для нанесения на глушители.

Еще 1 способ окрасить сборно-разборный мангал – применять порошковые составы.

На изделия наноситься порошковый слой, потом оно вмещается в печку. Сейчас плоскость станет более стойкой к высоким температурам и механическим воздействиям.

Но в условиях дома провести похожую отделку металла сложно.

Видео:

Еще 1 вариант как выполнить разборный мангал надежнее и прочнее – воронение металла. Так можно избегать нанесения красок, какие все равно нарушаются с каким то периодом.

Воронение металла – это изминение его химического состава. Процедуру оксидирования можно провести в домашних условиях.

Суть способа весьма проста:

  • Изделие нужно разобрать на части и обезжирить плоскости;
  • Любой из компонентов проваривается в растворе жидкого натра, который разбавляют по соотношению 5 к 100 с водой;
  • Варить нужно не меньше 90-100 минуток при температуре 140-150 градусов;
  • Потом изделие покрывается жароустойчивой чёрной пленочкой.

Если например выполнить складной мангал и отделать названным выше способом, он прослужит очень долго, плюс к этому не теряя симпатичного фасадного вида, не выделяя вредных веществ химии малоприятных ароматов.

Видео:

Но посещая пикнички пару раз за сезон, не стоит усложнять себе работу, достаточно наносить ранееназванную фарбу в баллончиках.

Абсолютно любой складной мангал в пластиковом чемодане и не только нуждается в уходе. Постоянно после применения он охлаждается и вычищается.

Чтоб не позволить коробления металла, избегайте проникания воды на горячие стены, воспрещено тушить. Раз в сезон его осматривают и ликвидируют обнаруженные дефекты.

Сколько стоит и где приобрести?

Если например кто-то не желает заняться обыдённой работой, есть возможность приобрести разборный мангал в дипломате. Он реализовывается на рынках, ремонтных супермаркетах, магазинах с домашними товарами.

Но цены на предлагаемый товар способны значительно колебаться. Стоимость мангала на 6-10 шампуров возникает от 20 у. е. и достигает нескольких сотен.

Она зависит от свойств качества используемого в изготовлении металла, прикладываемого в дополнение набора шампуров, решеточек гриль и т. д.

Перед тем как приобрести складной мангал, нужно уточнить все его свойства.

Думаем Вам понравилась заметка — Разборный (складной) мангал собственными руками

Содержание статьи

Мангал c электрическим приводом (электроприводом)

Похожие статьи

Навигация по записям

Как сделать мангал металлический, стационарный и складной самостоятельно

С наступлением теплых весенних дней многие задумываются о выезде на природу или на дачу, чтобы отдохнуть после зимней стужи и полакомиться вкусными шашлыками с настоящим ароматом дымка хвойных, вишневых, абрикосовых или яблочных веточек. А для этого нужен металлический мангал. Естественно, его можно приобрести в магазине, но если не полениться потратить несколько часов своего времени, то можно сделать своими руками отличный мангал из металла, который порадует вас и ваших близких вкусным шашлыком. шашлыки уже много лет.

Содержание

  • 1 Плюсы и минусы металлического мангала. Его особенности
  • 2 Подготовка к строительству: чертежи, схемы, какие должны быть оптимальные размеры и устройство
  • 3 Изготовление стационарного шашлыка из металла своими руками: пошаговая инструкция
  • 4 Чем отделать железный мангал, и можно ли его покрасить?
  • 5 Проекты, эскизы и особенности изготовления сборно-разборного мангала
  • 6 Видео: мангал в виде чемодана

Плюсы и минусы металлического мангала.Его особенности

Если вы решили сделать мангал своими руками из металла( стали), вам в первую очередь нужно решить, какой размер будет оптимальным для удовлетворения потребностей всей вашей семьи, и какой металл дольше всего прослужит вашим целям.

На сегодняшний день существует очень много разновидностей мангалов, которые могут быть изготовлены из самых разных материалов, но среди них самым популярным является металл, так как он имеет множество неоспоримых преимуществ таких как:

  • Мобильность. Даже если мангал не раскладывается, его все равно можно легко переместить в любое подсобное помещение (подвал, кладовую, гараж, кладовку), где он будет надежно стоять от воздействия различных атмосферных осадков до следующего использования.
  • Огнестойкий. Даже при периодическом сильном возгорании дров или угля размеры и металл мангала могут предотвратить возникновение пожароопасной ситуации. Металл может сильно нагреться, но так как он не горит, пожар не может возникнуть.
  • Доступная цена. Металл в настоящее время является наиболее доступным и недорогим материалом для изготовления любого типа мангала по сравнению с огнеупорным кирпичом, натуральным камнем или другими дорогостоящими материалами.
  • Скорость производства. При наличии материала и сварочного аппарата сделать такой мангал можно буквально за несколько часов и сразу эксплуатировать, в то время как кирпичную постройку придется делать минимум месяц и эксплуатировать не получится это еще на несколько дней.
  • Простота использования. Мангал из металла легко чистить, мыть и при необходимости разбирать или складывать (если он складной или складной).
  • Быстрое приготовление. Так как металл отлично держит тепло, мясо, овощи и другие продукты на нем приготовятся достаточно быстро и равномерно пропекутся.

Единственным недостатком данной конструкции можно назвать неэстетичный внешний вид. Но если вы мастер на все руки, то из металла можно сделать не просто мангал, а настоящее произведение искусства.Также металл подвержен коррозии, но если обработать его специальными антикоррозийными средствами и ухаживать за изделием из него, оно прослужит вам несколько десятков лет.

Фото: разновидности конструкции металлоконструкций

Давайте посмотрим, какие необычные и красивые мангалы можно сделать из железа, стали и подручных средств, если есть хоть немного фантазии и «золотых рук» мастера.

Подготовка к строительству: чертежи, схемы, какие должны быть оптимальные размеры и устройство.

. Размер мангала, который вы собираетесь изготовить, должен соответствовать вашим требованиям и учитывать все условия его эксплуатации.

  • Если ваша семья состоит из трех-четырех человек, то вы можете использовать размер изделия 50х30 см.
  • Ширина обычного мангала 30см. Это расстояние рассчитано на один шампур, на который поместится восемь-девять небольших кусочков свинины или телятины на порцию.
  • Длина мангала может быть разной в зависимости от количества шампуров, которые необходимо уложить рядом друг с другом.Расстояние между шампурами должно быть около 10 см, поэтому на 8 штук необходимо отмерить 80 см длины листа, на 10-1 метр и т. д. Но слишком длинный мангал делать не следует, так как он будет быть просто неудобным, и это окажется слишком громоздким и неудобным.
  • Глубина должна быть около 15 20 см. Этого объема будет достаточно, чтобы человек мог поместить в жаровню поленья или угли, а также мясо, чтобы оно при жарке не соприкасалось с горящими углями и не подгорало.
  • Высота «коробки» от дна до ножек должна быть такой, чтобы человек мог стоять ровно, держать шампур в согнутой руке и переворачивать его во время жарки шашлыка.
  • Для изготовления ножек можно взять уголки ( 25 — полки 30 мм) или четыре отрезка обычной арматуры (диаметр 8 10 мм).

Мангал стационарный и его чертеж

Какой материал выбрать для конструкции казана: нержавеющую сталь, железо и т.д.

Для сварки мангала лучше всего подойдет обычный листовой металл, из которого вырезаны дно и стенки изделия. Чем толще вы возьмете металл, тем прочнее и надежнее будет мангал, а также устойчивее. Обычно берут лист толщиной более 4 мм.

Размер листа должен быть:

  • ширина — 80 см — 90 см;
  • длина — 80 см — 100 см.

Стационарные модели должны быть толстостенными, так они будут иметь более длительный срок службы.Для изготовления ящика для сковороды можно взять нержавеющую сталь, обычный черный металл или жаропрочную сталь. Естественно, нержавеющая и жаропрочная сталь – самый оптимальный вариант для изготовления стационарного надежного мангала, но и более дорогой.

Если смотреть с точки зрения экономии, то лучше один раз купить хороший стальной лист и металлические профили( уголки или арматуру), чем потом ремонтировать мангал, который сгорит из-за некачественного металла. Черный металл со временем может проржаветь, а дно жаровни просто сгореть при частом использовании жаровни.Поэтому выбирать материал необходимо с учетом интенсивности эксплуатации будущего изделия.

Необходимые инструменты и материалы

  • Листовой металл (нержавеющая или жаропрочная сталь, простой черный прокат).
  • Уголки железные или арматура обычная(индивидуальная длина).
  • Угловая шлифовальная машина (болгарка), ножовка или электролобзик.
  • Мощная дрель.
  • Сварочный аппарат.

Изготовление стационарных шашлыков из металла своими руками: Пошаговая инструкция

  • На листе железа необходимо сделать разметку мелом в соответствии с разработанным планом чертежа.

Разметка металлического листа для будущего короба мангала

  • Боковины и дно конструкции вырежьте с помощью УШМ, ножовки или электролобзика.
  • В нижней части всех четырех стенок мангала необходимо просверлить симметричные отверстия по периметру, что облегчит приток воздуха снаружи для ускорения процесса розжига бревен или углей. Также на дне короба мангала можно сделать специальную перфорацию для постоянной циркуляции воздуха.

Перфорация дна мангала для лучшей циркуляции воздуха

  • Сверху по всей длине стенки нужно сделать отверстия для установки шампуров. Это может сделать болгарка. Расстояния между ними должны быть строго симметричны относительно противоположной стороны и иметь равные расстояния между собой.
  • Далее стенки и дно мангала необходимо сварить в некую прямоугольную коробку, которая будет составлять основную часть мангала.Все сварные швы следует хорошо зашлифовать болгаркой, чтобы они были ровными и имели привлекательный вид.

Мангал с пазами для укладки шампуров

  • Для изготовления ножек нужно взять уголки или арматуру и приварить ко всем четырем углам стенок. При желании можно сделать ножки откручивающимися. К днищу мангала нужно всего лишь приварить четыре гайки, а на арматуре нарезать резьбу для прикручивания ножек к основанию мангала. Гайки должны быть того же диаметра, что и диаметр арматуры.Тогда ножки можно легко раскрутить для более удобного хранения мангала в конце сезона.

Мангал с перфорацией дна

Чем отделать железный мангал, и можно ли его красить?

Давайте разберемся, нужно ли красить коробку мангала и для чего это нужно делать? Использовать краску и другие химически активные красители нежелательно, так как в процессе сжигания угля или дерева краска начнет облучаться, издавать неприятный запах, а мясо может поглощать вредные химические выделения.

Но сегодня современные производители могут предложить специальные средства для окрашивания всей конструкции мангала, совершенно безопасные для находящихся рядом людей и для приготовленного на нем мяса, овощей и других продуктов.

Проблема только в том, что температура внутри жаровни настолько высока, что любое покрытие (даже очень стойкое) может просто быстро сгореть и осыпаться.

Краски термостойкие для окраски мангала

На сегодняшний день существуют такие термостойкие краски, как:

  • Эмали силиконовые, хорошо выдерживающие температуру накаливания до +600 градусов Цельсия.
  • Порошковые термостойкие краски прекрасно подходят для покраски мангала, но их довольно сложно использовать, так как их нужно запекать при очень высокой температуре.
  • Процесс окисления достаточно сложен, но при желании его можно осуществить и в домашних условиях кустарным способом. Для этого ящик для барбекю нужно обработать 5% серной кислотой. Затем кипятят в густом растворе щелочного мыла и варят около полутора-двух часов в растворе натрия. После этих «водяных» процедур металл покроется черным антипригарным покрытием, которое сохранит его от появления коррозии.Но такой способ очень небезопасен, так как работа с таким химическим веществом, как серная кислота, требует большой осторожности.

Видео: конструкция стальной печи для шашлыков

Видео: самодельный вариант конструкции

Проекты, эскизы и особенности изготовления сборно-разборного мангала

Мангал разборный для дачи

Такой мангал очень легко разбирается на отдельные элементы, которые не займут много места при хранении.

Конструкция мангала не предусматривает сварку всех его частей, поэтому сварочный аппарат здесь может и не понадобиться. А для того, чтобы борта и ножки мангала можно было снять нам нужны только болты и гайки.

Чертеж сборно-разборного мангала

Как сделать
  1. Для начала необходимо разметить все детали изделия на листе железа. По бокам и внизу прибавьте около 4 см к стыкам, как указано на схеме.
  2. Затем нужно вырезать все детали.
  3. Для того, чтобы можно было гнуть листы, необходимо сделать небольшие надрезы на вырезанных боковых панелях по бокам. Тогда можно будет состыковать углы и легко заложить дно внутрь рамы.
  4. Для того, чтобы вся конструкция «коробки» жаровни не развалилась во время приготовления шашлыков на торцах стенок необходимо сделать отверстия и надежно зафиксировать их болтами.
  5. В верхней части бортов жаровни необходимо сделать углубления на одинаковом расстоянии для укладки шампуров.
  6. Ножки необходимо сделать из 4-х железных уголков, в которых также нужно сделать отверстия под болты, а также в углах смежных стен, к которым они будут крепиться.
  7. Для лучшего доступа воздуха в самом низу стенок ящика следует сделать небольшие отверстия дрелью или болгаркой.

Тип готового складного мангала

Сборный мангал

Также можно сделать марш во дворе своего дома и он станет отличным вариантом для загородных пикников.В сложенном виде — это небольшой железный чемоданчик с переносным устройством. Толщина этого «чемодана» всего 40 мм, а длина от 65 до 85 см. Это могут быть сложенные шампуры или решетка для гриля.

Мангал разборный в виде чемодана

Как сварить
  • Из листа железа необходимо вырезать дно мангала и просверлить по бокам круглые отверстия сверлом диаметром около 10 мм для притока воздуха. Затем согните боковины по линии, указанной на чертеже.

Чертеж дна складного мангала

  • Вырежьте боковые панели (размер 62х20,5 см).
  • Для того, чтобы они легко складывались внутри «чемодана», между дном и стенками необходимо закрепить две небольшие петли(балдахины). Это можно сделать с помощью шурупов или сварки.
  • Далее необходимо вырезать торцевые съемные стенки. В собранном виде они будут вставлены в боковые и нижние части. Для этого по всем краям боковых стенок следует сделать прямоугольные тонкие прорези.

Чертеж мангала разборного

  • К низу днища нужно приварить четыре гайки, которые необходимы для прикручиваемых ножек.
  • Для их изготовления необходимо взять четыре прутка арматуры, длиной 60 см и на каждом из них сделать резьбу (1 см М8). При сборке ножки можно вкрутить приварными гайками.

Мангал складной — сборка

  • Для удобства переноски мангал дополнен специальной металлической ручкой, которую можно просто приварить или прикрутить гайками.
  • Для того чтобы мангал закрывался как «чемодан» необходимо закрепить защелку или крючок на одной из стенок.

Мангал складной — вид в сложенном виде

Видео: мангал в виде чемодана

Какой бы вид мангала вы ни выбрали (стационарный, складной или складной), у каждого из них есть свои неоспоримые преимущества, в которых вы сразу убедитесь, как только как хочется сделать шашлык на своем приусадебном участке, или отправиться в семейный поход на природу.Мангал, сделанный своими руками, будет радовать вас долгие годы, и вы сможете гордиться своей работой.

Жаровня Селин — Складной город 2015.

  • Спрашивай о чем угодно
  • Архив

Складной город 2015.

11 нот

17 сентября 2015 г.

  • Открыть в приложении
  • Фейсбук
  • Твитнуть
  • Пинтерест
  • Почта
  • Вставить
  • Постоянная ссылка
  1. Nicoladestefanis понравился этот
  2. 02050104 сделал (а) celynbrazier
  3. га nnahthehan понравилось это
  4. celynbrazier разместил это

мангал для нагрева воды в чайнике (в чайной)

Текущее местоположение
Все галереиРасположение галереи UMMA ➜ AMH, 1-й этаж ➜ 101 (прихожая)Расположение галереи UMMA ➜ AMH, 1-й этаж ➜ 102 (Галерея Ричарда и Розанн Ноэль)Расположение галереи UMMA ➜ AMH, 1-й этаж ➜ 103 (Marvin H. Галерея Дэвидсона) Расположение галереи UMMA ➜ AMH, 1-й этаж ➜ 109 (Лиззи и Джонатан Тиш Апсе) Расположение галереи UMMA ➜ AMH, 1-й этаж ➜ 115 (ArtGym) Расположение галереи UMMA ➜ AMH, 2-й этаж ➜ 200 (Галерея А. Альфреда Таубмана I) )Расположение галереи UMMA ➜ AMH, 2-й этаж ➜ 201 (Тиффани: между дверями Таубмана I)Расположение галереи UMMA ➜ AMH, 2-й этаж ➜ 205 (галерея кабинета-склада Альбертины Монро-Браун)Расположение галереи UMMA ➜ AMH, 2-й этаж ➜ 206 ( Галерея Томаса Х. и Полли В. Бредт) Расположение галереи UMMA ➜ AMH, 2-й этаж ➜ 211 (Тиффани: между дверями Тиффани и соединителем FFW) Расположение галереи UMMA ➜ FFW, 1-й этаж ➜ 124 (Ирвинг Стенн-младший.Family Project Gallery)Расположение галереи UMMA ➜ FFW, 2-й этаж ➜ 212 (Галерея А. Альфреда Таубмана II)Расположение галереи UMMA ➜ FFW, 2-й этаж ➜ 213 (Галерея Роберта и Лилиан Монтальто Болен)Расположение галереи UMMA ➜ FFW, 2-й этаж ➜ 216 (Японская галерея)Расположение галереи UMMA ➜ FFW, 2-й этаж ➜ 217 (Галерея искусства Южной, Юго-Восточной и Центральной Азии)Расположение галереи UMMA ➜ FFW, 2-й этаж ➜ 218 (Элеонора Нойес Крампакер)Расположение галереи UMMA ➜ FFW, 2-й этаж ➜ 219 (Лифт — Административный вестибюль) Расположение галереи UMMA ➜ FFW, 2-й этаж ➜ 221 (кабинет директора) Расположение галереи UMMA ➜ FFW, нижний уровень ➜ 053 (Витрины учебного центра) Расположение галереи UMMA ➜ FFW, мезонин ➜ M01 (Джоан и Галерея современного искусства Роберта Тиша) Расположение галереи UMMA ➜ FFW, Мезонин ➜ M02 (Галерея современного искусства Джоан и Роберт Тиш) Расположение галереи UMMA ➜ FFW, Мезонин ➜ M04 (Галерея современного искусства Джоан и Роберт Тиш) )Расположение галереи UMMA ➜ FF W, Mezzanine ➜ M05 (Семейный мост Яна и Дэвида Брэндонов) Расположение галереи UMMA ➜ FFW, Mezzanine ➜ M06 (Галерея китайского искусства Ширли Чан) Расположение галереи UMMA ➜ FFW, Mezzanine ➜ M07 (Галерея корейского Art)UMMA Gallery Location ➜ FFW, Лестницы ➜ S08 (Лестница 8)

Алюминиевая головка жаровни SupraTite® серии

ATT-07/бритвенная — компания Industrial Rivet & Fastener

Вопросы дизайна

Диапазон захвата:
Определение длины заклепки имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы заклепка функционировала должным образом. Если заклепка установлена ​​выше или ниже предполагаемого диапазона захвата, она может работать неправильно. Все производители указывают диапазон толщины материала, при котором продукт будет работать должным образом. Эту толщину обычно называют диапазоном захвата. Установка заклепок за пределами их указанного диапазона захвата может привести к функциональным сбоям. Заклепки, установленные с перехватом, не будут удерживать головку оправки, что приведет к ее выпадению из тела заклепки после установки. Заклепки, установленные под захватом, могут изгибаться и смещаться, что снижает общую прочность и эстетический вид.Несоблюдение диапазона захвата также может привести к преждевременной поломке или затруднениям при извлечении израсходованной оправки из установочного инструмента.

Также не забудьте учесть теоретический захват по сравнению с фактическим захватом. Хотя сцепление можно рассчитать путем сложения толщин двух материалов, не забудьте учесть любые заусенцы, изгибы и производственные допуски, которые могут увеличить или уменьшить общее сцепление склеиваемых материалов.

Размер отверстия:
Размер отверстия чрезвычайно важен для правильного функционирования вытяжных заклепок.Мы указываем размер отверстия для каждой производимой нами заклепки. Заклепка гарантированно будет функционировать должным образом только в том случае, если размер отверстия находится в пределах предписанного диапазона. Кроме того, инженер-конструктор должен рассчитать производственные допуски отверстия, чтобы обеспечить правильную посадку и избежать проблем с помехами позже.

Соединительные материалы и прочность:
Иногда необходимо использовать разнородные материалы, например, для крепления алюминия к стали или пластика к алюминию.По возможности, более прочный материал должен быть вторичной стороной, потому что именно здесь будет происходить схватывание. Как правило, заклепку следует использовать в материалах, равных или превышающих ее собственную прочность, хотя можно изготовить специальные заклепки для работы с более мягкими материалами. Обязательно проверьте совместимость материалов заклепок, так как может возникнуть гальваническая коррозия, которая редко учитывается на этапе проектирования.

Зазор инструмента:
Необходимы достаточные зазоры, чтобы инструмент мог беспрепятственно добраться до заклепываемого соединения.Обязательно учитывайте клепальное оборудование на этапе проектирования, чтобы предотвратить необходимость в индивидуальных и потенциально дорогостоящих модификациях инструментов.

Зазор в головке:
Осевой доступ требуется на основной заклепываемой стороне, чтобы фланец мог беспрепятственно перекрывать отверстие. При проектировании основного отверстия обязательно рассчитывайте диаметр головки и его допуски, а также площадь расположения головки вокруг отверстия. Это особенно важно при заклепке кронштейнов и другого оборудования рядом с изгибами, складками, выступами и/или вырезами в приложениях.

Зазор с глухой стороны:
Поскольку глухая сторона заклепки предназначена для образования вторичного фланца, важно оставить место для фланца, чтобы он мог расшириться и правильно сесть. Имейте в виду, что высота в сложенном виде меньше, чем предустановленная высота. Поэтому перед заклепыванием убедитесь, что вторичная сторона может вместить всю длину заклепки (включая головку оправки). Тестирование должно проводиться на этапе проектирования, чтобы рассчитать необходимые расстояния и проверить правильность функционирования.

Защита от коррозии:
Коэффициент коррозии конкретной заклепки зависит от коррозионной активности основного металла, защитного слоя (покрытие) и конверсионного слоя (хромат). Поскольку наиболее рентабельным материалом для производства является сталь, большинство предпочитает защищать сталь покрытием, таким как хромат цинка, или покрытиями из других сплавов. Поскольку на глухие заклепки наносится покрытие до их сборки, не пытайтесь наносить покрытие на собранную заклепку.Для стандартных характеристик рейтинг SST составляет 24 часа до появления красной ржавчины. Доступны другие покрытия, такие как сплавы цинка (цинково-никель, цинк-железо, олово-цинк), которые могут увеличить рейтинг SST до 840 часов до появления красной ржавчины. Все указанные покрытия тестируются RivetKing в соответствии со стандартами ASTM B117.

Обратный путь. Искусство Америки в Испании — Выставка

Во второй половине семнадцатого века «прекрасные картины» (как они перечислены в инвентарных списках) начали отправляться из Америки в религиозные общины и величественные дома в Испании.Они были любимыми подарками или религиозной пропагандой, но также и сами по себе объектами художественной ценности.

Эти полотна оказались, в частности, в северной Испании и Андалусии, местах происхождения сотен эмигрантов, разбогатевших или получивших дворянство по ту сторону Атлантики. Фотографии поступали в основном из Лимы и Мексики. Фактически, мастерские Мехико экспортировали почти четверть своей продукции, снабжая торговый путь, который шел из Центральной Америки и Карибского бассейна на Канарские острова и материковую Испанию.Мастерские Кито и Куско также обслуживали потребителей во всех провинциях южного конуса.

Разнообразие форматов и жанров этих путешествовавших туда и обратно полотен свидетельствует о техническом развитии американской живописи, а также о ее разнообразии и специфике.

Атлас благочестия между Старым и Новым миром

Священные изображения составляли «зодиакальный» или планетарный атлас в каждом христианском царстве. Таким образом, соответствующие святилища Марии считались «домами», которые акцентировали течение времени и устанавливали общее пространство для различных владений монархии.Поэтому не случайно американские культы, представленные 90 353 истинными изображениями 90 354 или точными копиями религиозных изображений, которые связывали семьи по обе стороны океана, должны были занимать особое место в испанских алтарях и ризницах.

Культы, прибывшие из Испании, были захвачены художниками Нового Света, и некоторые из этих картин даже были отправлены обратно среди имущества репатриантов и выставлены в местах их происхождения в качестве дани.Обратный поток на Пиренейский полуостров наполнил эти религиозные образы новыми символическими значениями и указывает на широко распространенную религиозность и общий визуальный язык, который, однако, не лишен оригинальности и местного колорита.

Аллегории непорочного зачатия

Защита тайны Непорочного зачатия Марии, наследия бывшей короны Арагона, была почти делом государства для монархии Габсбургов и средством выражения и коммуникации для местной и корпоративной идентичности Америки.

Представленные аллегорические произведения показывают, что неудивительно, что в результате этого королевского повышения защиту дела взяли на себя семьи вице-королей Перу и Новой Испании – графа Лемоса и герцога Альбуркерке соответственно. Варианты иконографии включают серию ангелов-аркебузиров, носителей атрибутов добродетелей Марии.

Аллегории Евхаристии

Догмат пресуществления Евхаристии защищала и испанская монархия, что можно увидеть на картинах, где сам король, осажденный протестантами и турками, изображен держащим евхаристическую чудовище.Преданность каждой территории также сыграла свою роль в этом обязательстве. Ярким примером является изображение со-покровителей Наварры, святого Фермина и святого Франциска Ксаверия, по обе стороны от чудовища, которое иконографически изображает герб королевства.

Родной Апеллес

американских художника знали о своем техническом качестве и мастерстве в альтернативных темах и иконографиях. Вследствие этого они с гордостью заявляли о благородстве своего искусства и месте его производства и, конечно же, о своем статусе в обществе, и хотя вице-королевские власти всегда признавали живопись свободным искусством, они не устанавливали академической системы до восемнадцатого века. век.

Список великих американских художников начинается с первых художников, эмигрировавших в Новый Свет во второй половине шестнадцатого века, таких как Анджелино Медоро. Влияние Золотого века Испании — и его связи с Фландрией и Италией — проявляется в местных художниках, таких как Кристобаль де Вильяльпандо, Хосе де Ибарра, Мигель Кабрера и Хуан Патрисио Морлете, которых высоко ценили покровители-эмигранты. Они экспортировали свои изысканные картины, которые пользовались благосклонным приемом и стали востребованы за пределами Новой Испании.

Портативная кисть

Медные пластины продавались по высоким рыночным ценам из-за самого материала и часов работы, затраченных на то, чтобы сделать их пригодными для использования в качестве опор для рисования. Опираясь на фламандскую традицию, хорошо известную в Америке, художники использовали кропотливую работу кистью с полированной отделкой, чтобы превратить их в изысканные предметы. Кроме того, их можно было легче и безопаснее транспортировать, чем холсты, которые нужно было сворачивать, и они становились идеальным подарком для коллекционирования.

Большие тарелки особенно ценились как драгоценные предметы, такие как две представленные здесь, которые связаны с ностальгией по вымершему Обществу Иисуса. Ценность этих картин можно было бы также увеличить, если бы они были снабжены кованой серебряной рамой, как у Девы Гваделупской, которая висит на почетном месте над местом архиепископа в капитуле собора Сантьяго-де-Компостела.

Как сделать мангал своими руками из металла

Ни один праздник, организованный на дачном участке или при выезде на природу, не обходится без шашлыка или других мясных, рыбных, овощных блюд, приготовленных на углях, поэтому в арсенале любого хозяина обычно имеется такое удобное приспособление, как барбекю. этот полезный «полевой» кухонный инвентарь, но его вполне можно изготовить своими руками. Главное, правильно представлять себе, как сделать мангал своими руками из металла, иметь для этого необходимые инструменты и материалы, иметь определенные навыки слесарного дела.

Первым делом необходимо определиться с наиболее удобной моделью, так как мангал может быть стационарным, постоянно стоящим на участке, или разборно-мобильным.

Стационарный мангал может быть многофункциональным, так как при его изготовлении, добавив несколько дополнительных элементов, можно получить не только мангал-барбекю, но и мангал, барбекю или даже коптильню.К тому же такой мангал иногда становится настоящим украшением ландшафтного дизайна участка.

Мобильный гриль по-своему хорош — он компактен и помещается в багажнике автомобиля. Этот вариант идеален для тех, кто любит часто выезжать не только на дачу, но и на природу. Подобный мангал может быть разборным или складным.


Инструменты и материалы для изготовления барбекю

Мангалы могут быть разными, но материалы, а также инструменты для их изготовления в принципе не отличаются друг от друга. Единственное, чем может отличаться количество материала, так как если вы планируете сделать стационарный мангал с крышей и дополнительным декоративным оформлением, то различных элементов и металла вам понадобится гораздо больше.

Итак, для работы вам понадобится:

— сварочный аппарат;

— УШМ — «болгарка» с необходимым количеством отрезных и шлифовальных кругов;

— электродрель с набором сверл необходимых диаметров;

— электролобзик с режущими элементами по металлу;

— рулетка квадратная;

— отвертка;

слесарный инструмент — молоток, клещи, керн.

Из материалов вам нужно будет приобрести:

— металлический лист толщиной 2÷3 мм, старый газовый баллон или металлическая бочка;

— уголок металлический, размером 25х25 или 20х20мм;

— труба-квадрат со сторонами 20×20 мм;

— крепежные изделия;

— для некоторых мангалов с крышкой потребуются петли и ручка для открывания;

— для мобильных мангалов, которые планируется перемещать по участку, для удобства понадобятся колеса. Их количество будет зависеть от выбранной модели – два, три или четыре.

Как сделать мангал своими руками из металла — несколько вариантов

Видов металлических мангалов много, и изготавливаются они по-разному, поэтому стоит рассмотреть некоторые из них, чтобы выбрать наиболее подходящий.

Мангал из металлической бочки

Бочка – отличный исходный материал для приготовления барбекю

Модель мангала из бочки может быть выполнена в двух вариантах — с крышкой и без.Первый из них делается из двух половинок бочки, а второй из одной.

Какой бы вариант не был выбран, сначала нужно нарисовать чертеж будущего мангала.

На рисунке должны быть четко видны и понятны все детали и их размеры. Один вариант чертежа представлен для примера, но в него вполне возможно внести изменения. Составленный план будет самым главным помощником в процессе изготовления.

Вторым моментом в работе над мангалом является подготовка всех элементов, из которых он будет собираться.

  • Читать этот процесс нужно, конечно же, с основного элемента — бочки… Его нужно разрезать, и сделать это можно двумя способами:

— Пополам, по высоте емкости — этот способ подходит как для первого, так и для второго варианта мангала.

— Другой способ, когда вырезается только верх ствола. Впоследствии вырезанный элемент станет крышкой для мангала.

Края разрезанной тары необходимо зачистить, освободив их от металлических заусенцев.

  • Подготовив бочку, можно ориентироваться, какого размера уголки потребуются для обрамления проема. Поэтому следующий этап – вырезание уголков и труб, которые впоследствии станут ножками и подставками для мангала.
  • Далее все крепления подготовлены — лучше всего приобрести их с небольшим запасом.

Изготовление жаровни

1. Мангал из полбочки сделать проще, чем с крышкой, закрепленной на его задней стенке. Чтобы было легче работать над верхней частью бочки, лучше всего начать с ножек и подставок. Их делают из квадратной или круглой трубы.

  • Если нет возможности согнуть трубу полукругом, под размер бочки, то, правильно рассчитав, можно сварить уголок из двух труб, а затем приварить к нему две трубы в виде Т-образной структура. Таких ножек с подставками должно быть две. Они свариваются между собой одной или двумя перемычками, а при желании их можно скрепить подобием корзины или сетки, на которой можно хранить дрова.
  • Далее половина ствола укладывается в подстаканники и приваривается.Все места сварки и швы лучше сразу зачистить, чтобы не вернуться к нижним частям мангала.
  • Тогда можно смело работать над половинкой ствола. Сначала к его краям приваривается уголок – он сразу придаст изделию опрятность. Кроме того, на такую ​​«полочку» будет удобно ставить шампуры.

Если мангал планировалось использовать еще и как гриль, то стойки для него можно закрепить, как показано на схеме, к подставке для контейнера или к бортам самого полурулета и к уголкам на его краях.

Если решено делать крышку из второй части бочки, ее также обваривают уголком. Затем к половинкам привариваются петли – и крышка готова. Чтобы крышкой было удобно пользоваться, к ней нужно прикрепить ручку и металлический держатель с подвижным креплением. Устанавливается с одной или обеих сторон мангала.

  • Чтобы мангал служил еще и для шашлыка, поверх половинки рулона можно положить сетку. Для нее в края ствола вкручиваются специальные опорные элементы.
  • Для обеспечения хорошей тяги в мангале в стенках нижнего полувалка просверлены круглые отверстия.

2. Во втором случае ствол не разрезают пополам, а вырезают из него заранее размеченную часть, имеющую в плане прямоугольную форму.

В этой модели пища, готовящаяся на костре, будет защищена от ветра задней частью бочки. На фото хорошо видно, как устанавливаются мангалы-барбекю.

  • При выборе этого варианта края бочки обваривать не нужно — их нужно только очень хорошо зачистить и закруглить.
  • Остальные работы выполняются в той же последовательности, что и в первом случае, а петли прикручиваются или привариваются к верхней части мангала и крышке. В этой модели держатель для крышки не нужен — при откидывании она будет опираться на верхнюю часть мангала.

Стоит отметить, что к этому мангалу можно добавить функцию коптильни. Для этого в боковой части крепится дымоход. В любой бочке сверху всегда есть горловина с пробкой, которую можно использовать для установки трубы.Но об этом нужно подумать заранее, прежде чем начинать резать бочку, так как отверстие нужно располагать в верхней части мангала.

При необходимости для удобства с боковых сторон бочки как в первом, так и во втором варианте можно устроить полки-столики. Для этого к бочке приваривают металлические скобы, на которые впоследствии закрепляют деревянное или металлическое покрытие.

Мангалы изготавливаются так же из газовых или кислородных баллонов. Но надо учитывать, что они будут уже и предназначены для коротких шампуров.

Как было сказано выше, к любому из описанных мангалов можно прикрепить колеса для удобства перемещения его по участку. Но описываемые варианты мобильны только в пределах территории загородного участка – перевозить его на дальние расстояния крайне неудобно.

Бочка или цилиндр – отличный материал для изготовления мангала. Всегда есть простор для фантазии — достаточно посмотреть, например, варианты, представленные на видео:

Видео: что можно сделать из металлической бочки или газового баллона

Мангал складной

Сборно-разборный или раскладной мангал не будет лишним в любом доме и даже в квартире.Он компактен, поэтому не занимает много места, так как легко поместится на полке в кладовке или антресоли. Такой мангал можно использовать не только при выезде за город, но и во дворе многоэтажки, разумеется, соблюдая все правила пожарной безопасности.

При планировании работы следует исходить из того, что в сложенном виде мангал выглядит как тонкий чемодан, в который поместятся все принадлежности для жарки мяса. Так, например, походные шампуры имеют длину не более 600 мм, значит, длина мангала может быть всего 630 ÷ 650 мм, а его ширина в разложенном виде 400 ÷ 450 мм.

Мангал, показанный на фото, не так уж и сложно сделать самостоятельно. Для его изготовления вам понадобится:

— стальной лист толщиной 2÷3 мм — из него будут изготовлены большие стенки мангала и установленные треугольные боковые элементы;

— уголки стальные 10×10 мм — обварят основные плоскости. Кроме того, такие уголки закрепляются во внутренней части стенок мангала и служат опорами для решетки из стальной проволоки;

— петли для крепления и складывания двух половинок мангала;

— с боков фиксируются откидные ножки, которые при разборке мангала подходят ровно по высоте его стенок;

— пруток стальной Ø 7 ÷ 8 мм — нужен для устройства ручки на половинках мангала;

— сетка стальная готовая или проволока для ее изготовления.

Производственный процесс

  • Лучше всего сначала сделать чертеж и нанести на него все размеры, чтобы потом не пришлось переделывать работу из-за малейшей неточности.
  • Далее нужно нарисовать на металле, а затем вырезать из него все необходимые детали:

— Две основные стенки мангала размером 400×630 мм или 450×650 мм.

— Квадрат 400×400 мм или 450×450 мм. Затем его разрезают по диагонали и получаются два равносторонних треугольника, которые будут жестко держать всю конструкцию.

— Вырезать заготовки из уголка, нужно 4 шт. 630 ÷ 650 мм и 4 шт. 400 ÷ 450 мм для обрамления стенок мангала и опор для мангала.

  • Далее нужно сделать два элемента на подвижных креплениях по типу мебели — это будут складные ножки мангала. Для этого из толстого металла вырезают четыре полосы, шириной 10 мм, или используют уголки. Их длина может быть от 400 до 600 мм, но чем выше будут ножки, тем неустойчивее будет конструкция.

Когда все элементы подготовлены, можно приступать к сборке мангала. Чтобы не отличить от заводского, нужно очень аккуратно выполнять работу.

  • Первым делом необходимо облагородить переднюю и заднюю стенки мангала, тщательно очистив и обварив их с трех сторон уголком.
  • Далее, разметив расположение сетки в мангале, приварить или прикрутить под нее уголки-стойки.
  • Следующим этапом разметить и приварить петли на стенках, с их длинной, не обваренной стороной, определенной ширины и легко сгибаться при сборке мангала.Угол открытого мангала должен быть 45 градусов, чтобы на его бока можно было легко вставить подготовленные металлические треугольники — боковые стенки.
  • В верхней части полотен просверливаются два отверстия, в них устанавливаются и ввариваются ручки, согнутые из стального прутка. При желании можно установить крючок, чтобы мангал не открывался при сборке.

В итоге можно собрать всю конструкцию полностью, уложить на ее дно металлическую сетку и попробовать приготовить шашлык.

Дополнительно при желании изготавливается насадка, которая поможет вам приготовить шашлык. В этом случае мангал станет многофункциональным. Для этого элемента вам нужно будет вырезать и сварить вместе пять элементов. Это боковые детали-насадки, имеющие в нижней части угол 45 градусов — они будут установлены вместо боковых треугольников, два длинных лобовых листа и установленная сверху решетка. Также можно сделать эту часть разборной – прорезать в боковых частях больших полотен отверстия и приварить к боковым частям узких полотен специальные крючки, которые должны легко входить в них.

Самодельный шашлык может стать украшением участка

Перед началом работы, конечно же, нужно сделать чертеж – его очень легко составить самостоятельно, так как в этом варианте нет сложных элементов. Закупив все необходимое, вырежьте заготовки, опираясь на размеры, указанные на чертеже.

В качестве примера можно рассмотреть готовый чертеж, и на его основе сделать свой, добавив в него элементы, которые сделают его более удобным в использовании.

  • Используется металлический лист толщиной 2÷3 мм, стальной уголок 10×10 или 15×15 мм, который будет необходим для изготовления ножек и каркаса для мангала. Если планируется обустройство полок с одной или обеих сторон мангала, то для их изготовления также потребуется уголок.
  • Детали мангала отмечены на металлическом листе. Если металл имеет небольшую толщину (около 2 мм), то его можно согнуть, избавив себя от лишних работ по сварке швов, соединяющих стенки и дно мангала.В этом случае, сделав разметку, получается четыре четырехугольника и форма креста.
  • Средняя часть — это дно мангала, а остальные четыре — боковые стенки. Их необходимо загнуть под прямым углом к ​​низу.
  • Далее в нижней части больших бортов получившегося ящика сверлятся круглые отверстия для поступления воздуха в угли.
  • В верхней части мангала вырезаны углубления для удобства укладки шампуров.
  • Затем из уголка варится каркас, в который будет устанавливаться мангал, а также основание для боковых полок.
  • Толстая сетка из стальной проволоки может быть размещена на раме с угла. На такое основание будет удобно ставить разделочную доску или посуду.
  • Дополнительно на ножках внизу конструкции от угла к ножкам закрепляется сетка или другое приспособление для хранения дров. В верхней части мангала можно закрепить ручки для его переноски для удобства.
  • Если есть желание, то из проволоки на металлических плоскостях делаются рельефные украшения в виде различных узоров.
  • Далее все готовое изделие зачищается металлической щеткой, а затем конструкция прокрашивается термостойкой краской, которая убережет ее не только от выгорания, но и от ржавчины.
  • После высыхания краски можно попробовать и пожарить первый шашлык.
Видео: мангал из металлического листа своими руками

Обладая необходимыми инструментами и опытом работы с ними, можно смело за два дня изготовить мангал, тем самым сэкономив немалую сумму из семейного бюджета.Выполнив работу качественно и аккуратно, вы можете быть уверены, что полученное изделие не будет отличаться от заводских образцов и надежно прослужит долгие годы.

Исследование последовательности промотора RAD17. гена репарации ДНК человека

RAD17 с использованием физиологического раствора человека и температурных условий.Мы разработали основанный на спектроскопии кругового дихроизма метод рН-титрования, за которым следует анализ кривых титрования в области производных, и обнаружили, что наблюдаемое поведение складывания в зависимости от рН может быть существенно различным и, в некоторых случаях, многофазным, с зависимостью от того, насколько быстро индуцируется свертывание i-мотивов. Интересно, что последовательность теломер человека демонстрирует необычный изотермический гистерезис, при котором процесс разворачивания всегда происходит при более высоком pH, чем процесс складывания. Для i-мотива RAD17 быстрое свертывание путем инъекции в раствор с низким pH приводит к трехфазному разворачиванию, которое полностью уменьшается, когда образцы медленно сворачивают ступенчатым образом посредством рН-титрования. Химический след последовательности RAD17 и рН-титрование dT-замещенных мутантов последовательности RAD17 использовали для разработки модели сворачивания и разворачивания RAD17 . Эти результаты могут предоставить ценную информацию, относящуюся к использованию i-мотивов в сенсорах и материалах, а также понимание потенциальной биологической активности последовательностей, образующих i-мотив, при ступенчатых или мгновенных изменениях pH.

Введение

i-мотив ДНК представляет собой неканоническую тетраплексную структуру, обычно образующуюся в условиях низкого pH (1, 2) в последовательностях с проксимальными гомополимерными дорожками 2′-дезоксицитидина (dC).В настоящее время исследования, связанные со структурами i-мотивов ДНК, варьируются от регуляции генов (3, 4, 5) до интеллектуальных датчиков, ДНК-переключателей и методов сборки наночастиц (6, 7). Общность релевантности и/или полезности i-мотивов для любой области в значительной степени зависит от рН-зависимого поведения складывания и разворачивания последовательностей, образующих i-мотив, и условий, которые на это влияют. Внутренними факторами, влияющими на поведение фолдинга, являются длина олигодезоксинуклеотида (8), длина и количество дорожек поли-dC (9), а также длина и нуклеотидный состав промежуточных дорожек, не являющихся поли-dC (10, 11, 12, 13).Внешние факторы, влияющие на структурные переходы i-мотивов, включают концентрацию соли и ее идентичность (1, 14, 15, 16), температуру (11, 17) и скопление молекул (18, 19, 20).

Вышеупомянутые факторы создают сложный набор экспериментальных переменных, которые необходимо учитывать при характеристике последовательностей, образующих i-мотив, in vitro. Физиологические солевые и буферные условия обычно имитируются для исследований поведения укладки и структуры биологически подходящих последовательностей, тогда как альтернативные условия могут использоваться для других приложений.Однако для любой новой последовательности, образующей i-мотив, основное внимание в первую очередь уделяется параметру, называемому переходным pH (pH T ), определяемому как pH при данной температуре, при которой 50% олигодезоксинуклеотида находится во внутримолекулярно свернутой состояние.

Оценка рН T для потенциальной последовательности ДНК, образующей i-мотив, обычно выполняется с использованием ультрафиолетовой (УФ), кругового дихроизма (КД) или ЯМР-спектроскопии (21, 22, 23). В типичном эксперименте записывают спектр набора изотермически уравновешенных растворов образцов, каждый из которых имеет уникальное значение pH.Затем собирают поглощение (УФ) или эллиптичность (CD) образцов при максимуме характеристической длины волны, ~260 нм в УФ-спектре и ~285 нм в спектре КД, или интенсивность характерного химического сдвига в спектре ЯМР. для каждого образца при каждом рН. Затем значения поглощения или вращения можно нормализовать и подогнать к модели сигмовидного уравнения, напрямую подогнать к модели сигмовидного уравнения или интерполировать с помощью сплайновой кривой для определения значения pH T . Эти подходы дают стационарную кривую перехода, которая быстро получается и может быть легко использована для сравнения pH-зависимой стабильности набора представляющих интерес последовательностей.

Несмотря на то, что это полезно для исследований потенциальных последовательностей, образующих i-мотив, типичные интервалы pH выборки слишком широки, чтобы дать полную картину поведения сворачивания i-мотива при соответствующих изменениях условий, таких как однонаправленное снижение или увеличение pH раствора, особенно когда скорость изменения рН неодинакова. Исследование подробных структурных переходов складывания и развертывания последовательностей, образующих i-мотив, может, как мы обнаружили, выявить необычное многофазное поведение структурных переходов.Для любых приложений, в которых i-мотив является основным чувствительным элементом, можно использовать поведение многофазных структурных переходов, чтобы получить очень конкретную информацию об изменениях окружающей среды в узких диапазонах pH. Кроме того, знание гистерезиса в структурных переходах i-мотивов при различных условных ограничениях может быть использовано для повышения точности датчиков i-мотивов. Это представляет особый интерес для применения олигодезоксинуклеотидов, образующих i-мотив, в клеточной среде, например, разработанных Modi et al. для ДНК-наномашин, используемых для определения изменений pH в живых клетках (24, 25).

Поведение биомолекул при складывании и конформационные состояния можно исследовать с помощью различных экспериментальных методов, таких как ЯМР-спектроскопия, резонансный перенос энергии Фёрстера и рентгеновская кристаллография, но каждый из них имеет свои недостатки по сравнению с КД-спектроскопией. В ЯМР используются высокие концентрации олигодезоксинуклеотидов, намного превышающие физиологически значимые, которые могут изменить уравновешенное состояние или структуру складчатых конформаций.Резонансный перенос энергии Фёрстера использует олигодезоксинуклеотиды, ковалентно модифицированные большими гидрофобными красителями, что приводит к образованию ненативной биомолекулы, а рентгеновская кристаллография не позволяет окончательно определить фазовую структуру раствора или исследовать структурные переходы. Для сравнения, спектроскопия КД представляет собой простой и широко доступный метод фазы раствора, который позволяет использовать физиологические условия и низкие концентрации олигодезоксинуклеотидов и не требует структурной модификации биомолекулы.

Здесь представлены спектроскопические характеристики сворачивания и разворачивания нескольких i-мотивов ДНК. Мы демонстрируем тщательный метод исследования поведения сворачивания i-мотивов с помощью спектроскопии КД, который имеет преимущество перед другими методами, такими как спектроскопия ЯМР, и показываем, что олигодезоксинуклеотиды, образующие i-мотив, ведут себя по-разному в зависимости от того, как образец сложен или развернут. Мы применили этот метод к последовательности теломер человека, к тому, что, как мы полагаем, является новой последовательностью, формирующей i-мотив, обнаруженной в промоторе человеческого гена RAD17 (26), и к dC 19 .Последовательность i-мотива RAD17 очень похожа на недавно обнаруженный i-мотив dC 19 (8), для которого dC-богатое ядро ​​последовательности отличается только одним 2′-дезоксигуанозиновым (dG) нуклеотидом. расположен точно в центре дорожки dC 19 . Все исследованные олигодезоксинуклеотиды проявляют уникальное многофазное разворачивающееся поведение, которое зависит от того, как изменяется рН, а в случае промоторной последовательности RAD17 демонстрирует стабильную конформацию при рН ~7 и физиологической температуре человека.

Материалы и методы

Синтез и очистка олигодезоксинуклеотидов

Все олигодезоксинуклеотиды, используемые в данном документе, были синтезированы с использованием стандартных фосфорамидитных процедур в центре синтеза ДНК в Университете штата Юта. Затем образцы обрабатывали 200 мМ пиперидином в течение 30 минут при 90°C перед очисткой с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием элюента с высоким pH для предотвращения сворачивания i-мотивов на колонке. Затем образцы подвергали диализу три раза по 12 часов каждый против ddH 2 O, лиофилизировали, ресуспендировали в ddH 2 O, проводили количественный анализ, а затем замораживали в виде концентрированных исходных растворов до тех пор, пока они не потребуются для экспериментов.Значения молярной абсорбции для всех исследованных олигодезоксинуклеотидов определяли методом ближайшего соседа.

рН-титрование с использованием спектроскопии КД

Каждый образец олигодезоксинуклеотида готовили с использованием буфера, состоящего из 20 мМ KP i , 12 мМ NaCl и 140 мМ KCl, уравновешенных при 37°C. Концентрации образцов составляли порядка ~ 1–3 мк М, определяемые индивидуально путем расчета количества, необходимого для обеспечения поглощения ~ 0,5 при 260 нм в УФ-спектре на основе молярной абсорбции.Спектры КД записывали при приращениях рН примерно 0,1–0,2, используя небольшие аликвоты 1 М LiOH для корректировки рН каждый раз до тех пор, пока не перестанут наблюдаться дальнейшие изменения в спектре КД. Для титрования с повышением рН был выбран LiOH, потому что 1) он не окажет значительного влияния на физиологические концентрации K + или Na + или не изменит концентрацию буфера при использовании в виде концентрированного раствора, и 2) потому что было продемонстрировано его действие. мало влияет на поведение сворачивания i-мотивов до тех пор, пока не будут получены концентрации выше 50 мМ (1, 15).Наши эксперименты обычно приводили к высокой концентрации Li + <10 мМ, что может повлиять на термическую стабильность на несколько градусов, но в целом должно оказывать минимальное влияние на изотермическую стабильность pH и сохранять желаемые физиологические условия соли и буфера. . Как только образец достиг полного разворачивания i-мотива, титрование было обращено с использованием 1 M HCl в той же процедуре до pH ~4,5. Эти два титрования включали то, что мы называем «циклом титрования А». В ходе двунаправленного титрования к образцу 2000- мкл л было добавлено не более 60 мкл л всего 1 М LiOH и 1 М HCl, что привело к изменению объема менее чем на 5 % во всех случаях. .Для полноты эксперименты также проводились путем титрования от высокого pH к низкому, а затем обратно к высокому pH таким же образом, что называется «циклом титрования B». Все титрования выполняли в трех повторностях, и каждый спектр представляет собой образец, уравновешенный в течение примерно 90 с после добавления аликвоты кислоты или основания.

Анализ данных рН-титрования

Спектры КД для любого данного образца сначала были преобразованы из исходной эллиптичности, θ , в молярную эллиптичность, [ θ ], по уравнению [ θ ] = 5 θ (10× C × l ) -1 , где C представляет собой концентрацию образца, основанную на поглощении при 260 нм в УФ-спектре, а l представляет собой длину оптического пути кюветы. Затем были проанализированы полученные в результате рН-зависимые спектры для титрования в любом заданном направлении изменения рН, и значения [ θ ] при экспериментально определенной максимальной длине волны, ~285 нм, в самом низком рН-спектре были извлечены из каждого рН-специфического спектр. Затем каждый набор значений из повторных титрований для каждого образца индивидуально нормализовали и наносили на график зависимости от pH, где нормализованные значения соответствуют доле популяции в свернутом состоянии [ x ]. Стандартный нелинейный регрессионный анализ был использован для математической характеристики каждого перехода, используя глобальный анализ тройных наборов данных в соответствии с формулой.1:

[x]=-11+e((-b1×pH)+b2)+1pHT=b2b1.

(1)

В ур. 1, [ x ] — свернутая популяция состояний (ордината) при заданном значении pH (абсцисса), а b # — параметры, которые можно подобрать с помощью нелинейной регрессии в MATLAB 2013b (MathWorks, Natick, MA). Остатки затем рассчитывали и наносили на график в зависимости от pH для оценки каждой кривой титрования на предмет многофазного поведения, на что указывает структура остатков.

Затем был использован второй метод анализа для оценки и, при необходимости, деконволюции и количественного определения кривых многофазного титрования.Для этого данные, используемые для анализа в соответствии с формулой. 1 были преобразованы в производный домен. Отрицательный наклон между каждой точкой данных i и i + 1, (Δ[ x ]/Δ p H ) i , i

+1, i +1, набор повторных данных был рассчитан и нанесен на график в зависимости от среднего значения pH между парными значениями, pH¯i,i+1. Это дает i t o t a l  – 1 точка данных для каждого повторного титрования.Затем тройной набор данных для каждого образца был объединен для данного образца и глобально нормализован, а затем уравнение 2 использовали для анализа данных рН-титрования в области производных: 2)2bj,3)pHT,j=bj,2.

(2)

В приведенном выше уравнении b j являются параметрами, которые должны соответствовать в MATLAB (MathWorks) с использованием нелинейного регрессионного анализа. Количество колоколообразных кривых j , использованных в подборе, варьируется от 1 до 3 во всех случаях для этой работы.Для каждой базовой колоколообразной кривой значение pH T было переопределено как значение pH, соответствующее самому крутому наклону в каждом нижележащем переходе, полученном из графика H , что отличается от стандартного определения pH T . После анализа данных титрования рН по формуле 2, результирующая линия наилучшего соответствия была преобразована обратно в нормализованную сигмоидальную форму (см. Вспомогательный материал) для сравнения с исходным, нормализованным тройным набором данных.

Чтобы присвоить заселенность каждому пику, интегрирование каждой отдельной колоколообразной кривой позволило суммировать общую площадь, которую затем можно было использовать для нахождения структурной заселенности, дающей начало каждому переходу, назначенному с использованием деконволюции по уравнению. 2. В дополнение к этой информации мы предоставляем относительную амплитуду, b 1 , и полную ширину на полувысоте (FWHM в единицах pH) пиков деконволютивного структурного перехода, найденных с помощью анализа по уравнению. 2. FWHM связано с b 3 уравнением FWHM=2.355б3/2. FWHM указывает на уровень кооперативности перехода, как и в предыдущей количественной работе Нестеровой и соавт. (27), в котором меньшие значения указывают на более высокий уровень сотрудничества. Пример рабочего процесса (рис. S1), репрезентативные спектры CD, зависящие от pH, и графики нелинейной регрессии в соответствии с уравнением. 2 (рис. S2–S22) и статистика соответствия (таблица S4) представлены во вспомогательных материалах.

Анализ термического плавления

Образцы в трех экземплярах растворяли в 20 мМ буфере Бриттона-Робинсона при заданном значении рН, а для контроля денатурации, вызванной нагреванием, использовали УФ-спектроскопию.Каждый раствор уравновешивали при 20°C в течение 5 минут и нагревали с шагом 1°C со скоростью 1°C мин -1 , с паузой в 30 с после каждого повышения температуры на 1°C для уравновешивания с последующей записью поглощение при 262 нм, до конечной температуры 100°C. Затем производный метод использовали для анализа полученных кривых термической денатурации при 262 нм.

Определение бромного следа

Процедура определения бромного следа адаптирована и модифицирована по сравнению с процедурой, описанной в литературе (28, 29, 30).Вкратце, олигодезоксинуклеотиды сначала были помечены 5′-радиоактивной меткой [ γ ]- 32 Р-АТФ с использованием полинуклеотидкиназы Т4. Условия реакции бромирования были следующими: 2 пмоль радиоактивно меченого олигодезоксинуклеотида добавляли к 200- мкл л раствора либо 20 мМ ацетатного буфера (рН 5), либо 20 мМ фосфатного буфера (рН 8), содержащего 4 мкл М немеченого олигодезоксинуклеотид. Во все реакционные смеси добавляли концентрированный исходный раствор KHSO 5 с получением конечной концентрации 240 мкМ М.К неконтрольным дорожкам добавляли концентрированный исходный раствор KBr, чтобы получить конечную концентрацию 240 мкМ М. Реакциям, включая контрольные, в которых не было источника брома, давали возможность протекать в течение 30 минут при комнатной температуре. Все образцы впоследствии гасили добавлением 2 мкл л 200 мМ буфера HEPES. Затем образцы трижды диализовали по 12 ч каждый против ddH 2 O, лиофилизировали, а затем ресуспендировали в 1 М растворе пиперидина. Пиперидиновую реакцию проводили при 90°C в течение 45 мин.Образцы, обработанные пиперидином, затем подвергали диализу три раза по 12 часов каждый против ddH 2 O, несколько раз лиофилизировали путем повторного заполнения пробирок Эппендорфа для образцов ddH 2 O каждый раз, чтобы гарантировать удаление пиперидина, а затем анализировали с помощью денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле. 20% 19:1 акриламид:бисакриламид. Результаты реакции бромного следа визуализировали с помощью авторадиографии с запоминающим люминофором, а профили интенсивности использовали для определения окружения спаривания оснований каждой полосы фрагмента, указывающего на расположение петли или ядра в структуре i-мотива.

Изотермическая разностная спектроскопия

Во время экспериментов по спектроскопии КД одновременно с каждым спектром КД регистрировался УФ-спектр. УФ-спектры для сканирования с самым низким и самым высоким pH вычитали друг из друга, получая изотермические разностные спектры (IDS). Результаты этого подхода идентичны результатам, полученным с помощью термического метода, описанного Mergny et al. (17) и характерны для состояния протонирования остатков 2′-дезоксицитозина. IDS содержатся на рис.S2–S22, ( B ) для всех исследованных олигодезоксинуклеотидов.

Результаты и обсуждение

Последовательности олигодезоксинуклеотидов

показаны последовательности олигодезоксинуклеотидов, использованные в этом исследовании. hTeloC представляет собой последовательность теломер человека, а dC 19 представляет собой наиболее pH-стабильную последовательность поли-dC, недавно идентифицированную Fleming et al. (8). Все последовательности, происходящие от промотора гена RAD17 , обозначены «R17» и включают, при необходимости, добавленные обозначения длины трека core poly-dC.Каждая последовательность, за исключением dC 19 , содержит три нуклеотидных хвоста, полученных из последовательности дикого типа, за исключением T 5 -R17, которая включает 5′-добавленную последовательность dT 5 , используемую для улучшения результатов анализа структуры бромного следа. . Хвосты были включены для того, чтобы в большей степени оценить поведение i-мотива в контексте окружающих нуклеотидов, расположенных проксимальнее самой центральной последовательности, которые могут способствовать или ингибировать стабильность i-мотива. Молярные коэффициенты поглощения УФ-излучения при 260 нм ( ε 260 ) включены в .

Таблица 1

Таблица 1

Олигодеоксидротидные последовательности Исследованы и их ультрафиолетовые молярные коэффициенты вымирания на 260 нм

0,2542

0,1370

0,2080

0,2053

0,2053

0,2053

0,2053

Имя Sequence ε 260 (L μ м -1 см -1 см -1 ) 90 870
hTeloC 5′-TAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA
дС 19 5′-CCCCCCCCCCCCCCCCCCC
R17 5′-CCACCCCCCCCCGCCCCCCCCCGGA 0. +2005
R17-4444 5′-CCACCCCTCCCCGCCCCTCCCCGGA
R17-3434 5′-CCACCCTCCCCTGTCCCTCCCCGGA
R17-3443 5′-CCACCCTCCCCTGTCCCCTCCCGGA
R17-4334 5′-CCACCCCTCCCTGTCCCTCCCCGGA
R17-4343 5′-CCACCCCTCCCTGTCCCCTCCCGGA
R17-3333 5′-CCACCCTTCCCTGTCCCTTCCCGGA 0.2071
T5-R17 A 5′-TTTTTTTTTCCCCCCCCCCGCCCCCCCCCCCCCGCCCCCCCCCCCGA 0. 2280 0.2280

PH Титрации человека Telomere I-Motif

Мы впервые изложили для характеристики характеристики складывания и разворачиваемой рН канонической последовательности i-мотива, hTeloC, в условиях физиологического раствора и температуры (37°C). Эта серия контрольных экспериментов была использована для проверки нашей методологии титрования рН, в первую очередь разработанной для оценки изотермической стабильности рН, когда рН раствора образца изменяется в одном направлении.i-мотив hTeloC подвергали двум циклам титрования. Цикл A выполняли путем введения исходного раствора олигодезоксинуклеотида (исходный pH ≈ 7,8) в раствор с pH 4,5, уравновешивания образца в течение примерно 30 минут, титрования до высокого pH, а затем обратного титрования до низкого pH. Цикл B выполняли путем введения исходного раствора олигодезоксинуклеотида в раствор с pH 8, титрования до низкого pH, а затем обратного титрования до высокого pH. Соответствующие переходные значения pH, подходящие параметры и процент населения приведены в таблице S1.

A показывает результаты цикла A: когда hTeloC вводили в раствор с pH 4,5 и постепенно добавляли аликвоты LiOH, медленное развертывание происходило двухфазным образом (, вставка 1 ). Титрование тех же образцов обратно в сторону низкого pH небольшими аликвотами HCl привело к монофазному переходу (, вставка 2, ).
B показывает результаты цикла B, в котором, начиная с высокого pH, медленное сворачивание было монофазным ( , вставка 2 ), но титрование обратно до высокого pH также было монофазным, но со смещением к несколько более высокому pH ( , вставка 1 ). ).Анализ с помощью уравнения. 2 показано, что hTeloC демонстрирует двухфазный переход для образцов, введенных в раствор с низким pH во время цикла A. Интегрирование перекрывающихся пиков колоколообразной кривой (
А ; , вставка 1 ), дали относительную популяцию ~13% (pH T,1 ) и ~87% (таблица S1, pH T,2 ), первая из которых имеет более низкую кооперативность, чем вторая, на что указывает низкая амплитуда (0,19) и относительно большой FWHM (0,47) в ( Δ x / Δ p H ) по сравнению сГрафик рН.

Циклы титрования hTeloC pH зафиксировали ~287 нм в спектре CD (точные значения см. в Таблице S4). Титрование с повышением pH показано черным цветом, а титрованием с понижением pH — красным. ( A ) На этой панели показан цикл A с увеличением pH (, вставка 1 ), затем снижением pH (, вставка 2 ). ( B ) На этой панели показан цикл B с уменьшением pH (, вставка 2 ), затем повышением pH (, вставка 1 ). На вставках представлены графики согласно уравнению. 2 для каждого направленного титрования рН.Таблица S1 содержит подходящие параметры, структурные совокупности (для многофазных кривых) и концентрации образцов. Таблица S4 содержит соответствующую статистическую информацию для каждой подгонки. ( ) указывает начальный pH для каждого цикла. Чтобы увидеть эту фигуру в цвете, зайдите в интернет.

Возможные причины двухфазной разворачивающейся кривой титрования (
A , , вставка 1 ) включают множественные конформационные топологии или образование димера. В 2012 году Либлейн и соавт. показали для последовательности теломер человека d((C 3 TA 2 ) 3 C 3 ), что скачки pH с 9 до 6 могут привести к кинетическому разделению, что приведет к образованию популяции 1:3 распределение конформаций от 3’E до 5’E соответственно при ~2°C (13, 31).При ~15°С соотношение смещается до 1:4, а при ~35°С конформация 3’Е уже не обнаруживается. Наши эксперименты проводились при 37°C, поэтому маловероятно, что конформационная топология является причиной наблюдаемого двухфазного развертывания для образцов, подверженных резкому снижению рН от среды маточного раствора до рН ~4,5.

В 2013 г. Wu et al. использовали аналитическое ультрацентрифугирование для изучения влияния скачков pH на формирование внутримолекулярных структур последовательности i-мотива теломеры человека d((C 3 TA 2 ) 3 C 3 (32).Они обнаружили, что человеческий i-мотив теломер склонен к образованию межмолекулярных димеров (∼18%) при таких низких концентрациях, как 2 мк М при скачке рН с 7,5 до 4,5 при 20°С. Концентрации олигодезоксинуклеотидов в наших экспериментах здесь составляли ∼1,8 μ М, хотя температура наших экспериментов была 37°C. Кроме того, Ву и соавт. показали, что димер менее стабилен, чем внутримолекулярный i-мотив, что также подтверждают наши эксперименты, предполагая, что диссоциация димера — это то, что мы наблюдаем при переходе с самым низким pH и низкой кооперативностью в
А , вставка 1.

Монофазное развертывание hTeloC после сворачивания посредством титрования от высокого pH до низкого pH во время цикла B (
B , , вставка 1 ), предполагает отсутствие образования димера. Медленное сворачивание в этом случае, вероятно, способствует формированию внутримолекулярного i-мотива. Действительно, Ву и соавт. показали, что отжиг, аналогичный медленному фолдингу с помощью рН-титрования, препятствует образованию димеров в аналитических экспериментах по ультрацентрифугированию (32). Поэтому мы предполагаем, что наше наблюдение двухфазного развертывания образцов, подверженных быстрому падению pH, согласуется с образованием небольшой субпопуляции димеров.

Второе наблюдение заключалось в том, что во всех случаях разворачивание hTeloC происходит при более высоком pH, чем складывание, независимо от того, как было получено свернутое состояние. В 2000 г. Фан и соавт. выполнили pD-титрование модифицированной последовательности теломер человека d(C 3 TA 2 5mCC 2 TA 2 C 3 UA 2 T 3 93 при 3 ). В то время они приписывали гистерезис медленной кинетике разворачивания и складывания; однако в 2012 г. Chen et al. показали, что переход разворачивания i-мотива теломеры человека происходит между ~120 мс и 150 с, в зависимости от приращения изменения рН в диапазоне структурного перехода (34).Альтернативная интерпретация основана на особенностях строения. Наблюдаемое более высокое значение pH T при разворачивании по сравнению с pH T при складывании может объясняться эффектом «запирания», при котором копланарные основания dT между параллельно ориентированными сегментами i-мотива образуют пару оснований dT:dT вобуляции (35 , 36). Для последовательности, изученной Phan et al., такая стабилизация будет происходить только на двухпетлевой стороне внутримолекулярного i-мотива топологии 5’E. Эта последовательность, hTeloC, включает 5′-TAA… и …TAA-3′ хвосты.В этом случае вполне вероятно, что вобубл-пары dT:dT также могут образовываться в топологии 5’E на однопетлевой стороне ядра между нуклеотидом dT второй петли и нуклеотидом 3′-хвоста dT (1). Также было показано, что топология 5’E является доминирующей укладкой i-мотива теломеры человека в растворе, независимо от того, быстро или медленно снижается pH (13, 33).

Модель топологии 5`E hTeloC. Потенциальные пары колебаний dT:dT, которые стабилизируют структуру во время разворачивания, показаны кольцами.Петли пронумерованы 1–3 от 5′-конца к 3′-концу. Чтобы увидеть эту фигуру в цвете, зайдите в интернет.

Переходы фолдинга в основном обусловлены образованием dC-dC + , инициированным протонированием нуклеотидов dC (34) в диапазоне pH, в котором состояние протонирования dT остается неизменным (37, 38). Это указывает на то, что пары dT:dT не играют роли в формировании i-мотивов, но они могут быть фактором, способствующим более высокому наблюдаемому разворачиванию pH T по сравнению со складыванием pH T .Важно отметить, что мы не предполагаем, что такое поведение является общим явлением для всех последовательностей, образующих i-мотив; скорее, это зависит от самой последовательности. Таким образом, наблюдаемый гистерезис, вероятно, связан с образованием пар колебаний dT:dT между нуклеотидами dT ( синих колец ) на каждой стороне интеркалированного ядра, что является уникальной особенностью изученной здесь последовательности hTeloC. Это, вероятно, приводит к устойчивости к разворачиванию и депротонированию dC-dC + , сдвигая рН перехода разворачивания к более высокому значению, чем рН перехода фолдинга, при котором образование колебательной пары dT:dT не способствует образованию i-мотива.

Изотермическое складывание и развертывание i-мотива

RAD17

pH-титрование i-мотива RAD17 (R17) проводили при 37°C и анализировали по уравнению 2. Эксперименты проводились аналогично проведенным для hTeloC. Результаты каждого цикла титрования суммированы в таблице S2.

В цикле титрования A R17 вводили в раствор с низким pH и титровали в направлении увеличения pH (
A , вставка 1 ). Переход структурного развертывания происходил здесь трехфазным образом (
А ; , вставка 1 ), в которой два перехода очевидны на графике, а третий — широкий, с низкой кооперативностью.При титровании тех же образцов обратно до низкого pH (
A , вставка 2 ) наблюдался двухфазный переход (
А ; вставка 2 ). В цикле титрования B (
B ), наблюдался двухфазный переход складчатости (, вставка 1 ), а титрование тех же образцов обратно до высокого pH (, вставка 2 ) не выявило ни гистерезиса, ни трехфазного развертывания. Вместо этого развертывание предполагало почти ту же самую зависимость от pH и количество фаз, что и титрование складывания в циклах 1 и 2.

R17 Циклы титрования pH, записанные при ~288 нм в спектре CD (точные значения см. в Таблице S4). Титрование с повышением pH показано черным цветом, а титрованием с понижением pH — красным. ( A ) На этой панели показан цикл A с увеличением pH (, вставка 1 ), затем снижением pH (, вставка 2 ). ( B ) На этой панели показан цикл B с уменьшением pH (, вставка 2 ), затем повышением pH (, вставка 1 ). На вставках представлены графики согласно уравнению. 2 для каждого направленного титрования рН.Таблица S2 содержит подходящие параметры, структурные совокупности (для многофазных кривых) и концентрации образцов. Таблица S4 содержит соответствующую статистическую информацию для каждой подгонки. ( ) указывает начальный pH для каждого цикла. Чтобы увидеть эту фигуру в цвете, зайдите в интернет.

Во всех случаях для R17 наименьшие переходы стабильности и кооперативности могли бы соответствовать образованию димера, аналогично нашему постулату для hTeloC, из-за меньшей стабильности и кооперативности межмолекулярных структур. В случае трехфазного развертывания образцов, введенных в раствор с низким pH, два самых низких пика pH T возникают почти одновременно, причем один переход намного более резкий и, следовательно, более кооперативный, чем другой. Нижний пик кооперативности лежит в основе почти всей области структурных переходов (
A , вставка 1 ) и составляет 48% от общего структурного населения (таблица S2). В трех других титрациях наблюдалась постоянная популяция, которая могла соответствовать димерам и всегда проявляла низкую кооперативность, соответствующую 25–31% популяции (таблица S2).Одна из интерпретаций заключается в том, что это происходит из-за образования димеров даже при медленном укладывании, вызванном титрованием. R17 почти поли-dC по составу нуклеотидов и не будет пространственно ограничен образованием димеров посредством случайных столкновений по сравнению с hTeloC. Ву и др. постулировали, что геометрия столкновений является ограничивающим фактором в образовании димера для hTeloC, который содержит всего 12 нуклеотидов dC (32). R17 имеет 18 нуклеотидов dC, содержащихся в двух дорожках dC 9 , разделенных одним нуклеотидом dG, что делает его гораздо менее конформационно ограниченным с точки зрения траекторий, ведущих к сворачиванию.Возможность образования межмолекулярных структур более высокого порядка, таких как тетрамерные i-мотивы или супрамолекулярные i-мотивы (39, 40, 41), остается, хотя окончательно отличить их образование от образования димеров с использованием нашего подхода невозможно.

Другая интерпретация основного перехода, демонстрирующего низкую кооперативность, включает нелинейность в свернутом и развернутом состояниях, что означает, что конкретный переход может быть артефактом анализа по уравнению. 2. Кроме того, свернутые состояния i-мотивов не обязательно наблюдаются в спектроскопии КД, поскольку неизменная молярная эллиптичность при максимуме вращения ~285 нм в низких диапазонах рН (т.е., ниже основной части диапазона структурного перехода). Анализ термодинамической связи показывает, что при снижении pH ниже pK a цитозина спектр CD снова будет уменьшаться, поскольку олигодезоксинуклеотиды, образующие i-мотив, становятся гиперпротонированными, тем самым диссоциируя свернутое состояние при чрезвычайно низких значениях pH (42).

Независимо от того, как мы интерпретируем лежащий в основе низкокооперативный переход в трехфазном развертывании R17, у нас все еще остается вопрос о том, что дает начало двум различным высококооперативным переходам (
A , вставка 1 ), которые встречаются при pH 6.1 и 7.0. Вычислительные и экспериментальные исследования процесса развертывания последовательности теломер человека d((C 3 TA 2 ) 3 CCCT) показывают, что на пути развертывания может происходить более одного этапа (34, 43, 44), хотя маловероятно, что эти шаги будут различимы во временных масштабах, относящихся к нашим экспериментам. Каждое из этих исследований показывает высокий уровень кооперативности в развертывании внутримолекулярных i-мотивов, поэтому мы предварительно отнесли каждый из вышеупомянутых резких переходов к отдельным структурам i-мотивов с разными значениями pH перехода при разворачивании.

Следует отметить, что гистерезис, наблюдаемый в цикле A, не наблюдается в цикле B (), в отличие от поведения hTeloC (). hTeloC обладает потенциальными взаимодействиями нуклеотидов петли и хвоста, которые могут происходить независимо от того, как достигается свернутое состояние, тогда как R17 не обладает теми же специфическими для последовательности свойствами, такими как взаимодействия петли dT:dT, которые могли бы придавать устойчивость к разворачиванию. Различия в цикле A и цикле B, вероятно, зависят от последовательности, но, скорее всего, из-за различий в топологии ядра (т.е., количество и расположение пар dC-dC + ), которые возникают из-за скорости изменения pH раствора во время сворачивания, ключевого различия между экспериментами цикла A и B. Чтобы проверить эту гипотезу, мы провели титрование мутантов R17, которые используют замены dT, чтобы ограничить свернутые конформации различными структурами ядра dC-dC + .

Влияние замен dT, отжига и концентрации на разворачивание R17 после быстрого падения pH раствор с низким рН (первое титрование цикла А).Здесь нас интересовало модулирование поведения трехфазного развертывания, отмеченного для R17 в

A (, вставка 1 ) в попытке определить наиболее вероятные конформации сворачивания последовательности дикого типа, которые приводят к многофазному развертыванию.

Таблица 2

Таблица 2

Данные структурных переходов и упорные параметры от анализа для мутантов R17 и R17-DT от цикла A с увеличением титров PH

90 (0.1)

последовательность pH T (± SD) (B 1 ) A FWHM FWHM (PH40869 BWHM (pH) B 9069 3 C C Концентрация ( μ m) D
R17 pH T 1 = 6.1 (0.1) 0.74 0.29 39 3.0 3
ph t, 2 = 6. 2 (0,2) 0.20 1,28 48
ph T, 3 = 7,0 (0,1) 0.22 0.33 13 13
R17-отжизненный pH T, 1 = 6.1 (0.1) 0.88 0.37 2,4
рН Т,2 = 6.2 (0.2) 0.09 1.90 35 35
R17 — низкая концентрация PH T, 1 = 6. 1 (0,1) 0,29 0.29 43 1,3
pH T, 2 = 6.2 (0.1) 0,81 1.43 40 40
ph t, 3 = 7,0 (0,1) 0,25 0.24 17
R17 4444 pH T,1 = 6.1 (0.1) 0.69 0.87 66 2 2
ph t, 2 = 6.7 (0,1) 0. 84 0.37 34
R17-3434 PH T, 1 T, 1 = 5.7 (0,1) 0.30 1.04 54 2.3 2
ph t, 2 = 5,8 (0,1) 0,29 0,29
рН Т,3 = 6,6 (0,1) 0,16 0,41 11 11
R17-3443

R17-3443 PH T, 1 = 5,2 (0,1) 0.11 0,47 10 2,6
ph T , 2 = 5,8 (0. 1) 0,97 0.44 78 78
ph t, 3 = 6,6 (0,1) 0.16 0,41 12
R17-4334 рН Т,1 = 5,6 (0,6).1) 0.24 0.74 42 42 2
ph t, 2 = 5.8 (0,1)

0.76 0.33 58
R17-4343 ph т , 1 = 5. 4 (0.1) 0.16 0,69 7 2 9 2 9 2 9
ph t, 2 = 5,9 (0,1) 0,95 0.44 73
ph T,3  = 6,6 (0,1) 0.24 0.47 20 9
R17-3333

R17-3333 PH T, 1 = 5,2 (0,2) 0.21 0.50 18 2.4
ph T, 2 = 5. 6 (0.1) 0.93 0.44 71 71 91 91

ph t, 3 = 6.4 (0.1) 0.10 0,60890

11
T 5 -R17 * pH T,1  = 6.1 (0.1) 0.26 1.15 46 2,5 9
ph t, 2 = 6.1 (0,1) 0.53 0.24 18
ph T, 3 = 7,0 (0,1) 0,60 0,41 35

Визуальное сравнение dT-мутированных последовательностей R17 () показывает несколько аспектов сворачивания R17, которые указывают на наиболее стабильную конформацию свернутого состояния. На крайних значениях pH-стабильности находятся R17-4444 и R17-3333.R17-3434 и R17-4343 показывают почти одинаковое поведение, но в целом ниже, чем R17-4444. R17-3443 и R17-4334 также показывают почти одинаковое поведение. Данные обычно указывают на тенденцию, согласно которой чем больше нуклеотидов dT в этих позициях, тем менее pH-стабилен i-мотив. Это указывает на то, что ограничение диапазона конформаций, которые R17 может принимать в результате замены dT при сворачивании во время быстрого падения pH, снижает их структурную стабильность. Причины этого наблюдения включают увеличение гидрофобности олигодезоксинуклеотида (45) и уменьшение как числа основных водородных связей dC-dC + , так и возможных конфигураций ядра.

Сравнение развернутых кривых титрования pH для dT-замещенных мутантов R17 с R17 циклом A, кривые повышения pH и понижения pH. Обратите внимание, что показанные данные представляют собой линии регрессии из анализа с помощью уравнения. 2 и не показывают повторные точки данных из экспериментов по титрованию. Каждая кривая была записана на ~288 нм в спектре КД (точные значения см. в Таблице S4). Чтобы увидеть эту фигуру в цвете, зайдите в интернет.

Ранее d((C 4 T) 3 CCCC) была отмечена как наиболее pH-стабильная dT-мутантная последовательность dC 19 , но в целом менее стабильная, чем dC 19 (8).Одиночные нуклеотиды dT в первой и третьей петлях других последовательностей i-мотивов также были показаны как наиболее термически стабильные для четырех dC-dC + -парных ядерных структур i-мотивов (46). В соответствии с этими предыдущими исследованиями, наши данные предполагают, что ограничение конформационных возможностей i-мотива путем минимального изменения положения петель, как показано R17-4444, увеличивает популяцию, вызывая складку с наивысшей стабильностью в i-мотив R17 (), полученный путем воздействия на образец быстрого падения рН.Наоборот, R17-3333, который в наибольшей степени ограничивает конформационные возможности, приводит к значительному снижению общей рН-стабильности и уменьшению популяции структур с высокой рН-стабильностью (рН Т, 3 ; см. ). Конфигурации промежуточного контура показывают, что семь ядер dC-dC + (R17-3434 и R17-4343) более стабильны, чем шесть ядер dC-dC + (R17-3443 и R17-4334). Это говорит о том, что когда водородные связи между нуклеотидами dC максимальны, в целом достигается более высокая стабильность.

Интересно, что медленный фолдинг, по-видимому, не максимизирует количество пар dC-dC + , когда фолдинг индуцируется в последовательности R17 дикого типа (10). R17-4343 и R17-3434 лучше соответствуют кривой медленного складывания, чем R17-4444. Небольшое отставание в диссоциации, отмеченное для R17-4343 и R17-3434 при ∼pH 6,5, возможно, является остановленным процессом развертывания, на что указывает более низкая кооперативность этих переходов. В этом случае медленная укладка может фактически способствовать вкладу других факторов в укладку i-мотивов, таких как взаимодействия петля-петля, петля-хвост и хвост-хвост, которые требуют более длительного времени для образования, что невозможно при быстром падении рН. .В качестве альтернативы они могут быть связаны с небольшой популяцией высокостабильной альтернативной складки, но наш набор данных не способствует такому определению.

Помимо замены петли dT, мы исследовали влияние термического уравновешивания и концентрации олигодезоксинуклеотидов на разворачивание R17. показывает разворачивание R17 после инъекции в раствор с низким pH и медленное повторное складывание посредством титрования (те же данные, что и для
A ) по сравнению с развернутой кривой титрования образца R17, который вводили в раствор с низким pH, нагревали до 85°C, а затем медленно охлаждали до 37°C перед титрованием в направлении увеличения pH.также показано влияние уменьшения концентрации R17 в два раза на общую развернутую кривую титрования образцов, введенных в раствор с низким pH.

Графики кривой титрования R17 ∼288 нм в спектре CD (точные значения см. в Таблице S4). R17 титровали в направлении увеличения рН после введения в раствор с низким рН в концентрации ~3 мк М ( R17-Cycle A Up ) и ~1,3 мк М ( R17-Low Conc. ). ( R17-Annealed ) Показаны данные для R17, титрованного в направлении увеличения pH после введения в раствор с низким pH и отжига при 85°C.( R17-Cycle A Down ) показаны данные титрования тех же образцов из «R17-Cycle A Up» в направлении уменьшения pH. Обратите внимание, что показанные данные являются линиями регрессии из анализа по уравнению. 2 и не показывают повторные точки данных из экспериментов по титрованию. Чтобы увидеть эту фигуру в цвете, зайдите в интернет.

В эксперименте по отжигу (, R17-Annealed ) наблюдалось явное снижение стабильности pH, а также потеря поведения при трехфазном развертывании. Общая кривая титрования отожженного образца предполагает переход, аналогичный двухфазной кривой сворачивания R17 (, R17-Cycle A Down ).Таким образом, мы заключаем, что отжиг способствует формированию структурных популяций, которые больше похожи на складчатые образцы R17, полученные титрованием от высокого pH до низкого.

Уменьшение концентрации R17 в два раза (, R17-Low Conc. ) для образцов, введенных в раствор с низким pH, по-видимому, только уменьшает образование популяции с низкой кооперативностью (∼40%) по сравнению с таким же образом обработан R17 с более высокой концентрацией (~48%). Это указывает на то, что концентрация влияет на образование того, что, вероятно, является димером, хотя чувствительность нашего прибора CD недостаточно высока, чтобы допустить дальнейшее снижение концентрации без значительного увеличения интенсивности шума.

Чтобы гарантировать, что наше наблюдение трехфазного развертывания не было результатом слишком быстрого титрования, что привело к записи неуравновешенного спектра КД, мы титровали отдельный набор образцов R17 от низкого до высокого pH после введения в среду с низким рН раствор. Мы приостанавливали этот эксперимент в каждом повторном титровании при pH ~ 6,4 на 10 минут, что на порядок больше, чем самое продолжительное время уравновешивания, используемое для изучения последовательности теломер человека (34). В этой точке возникает наибольшая разница между кривыми титрования с увеличением и уменьшением рН в цикле А.Результаты этого эксперимента показаны на рис. S24. Население свернутого состояния в эксперименте с паузой показало, что устойчивый спектр КД сохраняется при рН ~ 6,4 после введения образцов в раствор с низким рН и титрования до этого рН. Если система i-motif не была уравновешена, падение популяции в свернутом состоянии должно было бы наблюдаться как изменение спектра CD во время паузы, но этого не происходило.

Важно отметить, что наблюдение более высокой стабильности pH при разворачивании в быстро свернутых образцах R17 () по сравнению с отожженными образцами R17 указывает на то, что наиболее термически стабильные конформации i-мотивов, полученные в результате отжига, могут не отражать наиболее стабильную конформацию при складывании. индуцируется при определенной температуре.Как продемонстрировали Lieblein et al. для i-мотива теломер человека температура раствора во время эксперимента со скачком pH, аналогичная подготовке образца здесь перед проведением цикла A титрования с увеличением pH, значительно сдвигает конформационное равновесие между топологиями 3’E и 5’E, в которых фаворитизм для 3 Топология ′E растет при понижении температуры ниже ∼35°C (13, 31). В процессе отжига i-мотив может достичь стабильной конформации, за пределами которой дальнейшее понижение температуры может не вызвать перегруппировку в более предпочтительную форму при более низкой удельной температуре.Это открытие указывает на то, что необходимо проявлять крайнюю осторожность при оценке структурных переходов отожженного i-мотива, если цель состоит в том, чтобы оценить их отношение к биологической активности или использованию в сенсорных приложениях, которые обычно происходят или осуществляются в изотермических условиях.

dC

19 изотермическое складывание и разворачивание

Чтобы провести сравнение между R17 и dC 19 , мы провели pH-титрование dC 19 таким же образом, как это было сделано в двух циклах титрования, и с R17 ( hTeloC ().показывает результаты этих экспериментов. Значения переходных значений pH и подходящие параметры представлены в таблице S3.

dC 19 Циклы титрования pH, зарегистрированные при ~288 нм в спектре CD (точные значения см. в Таблице S4). Титрование с повышением pH показано черным цветом, а титрованием с понижением pH — красным. ( A ) На этой панели показан цикл A с увеличением pH (, вставка 1 ), затем снижением pH (, вставка 2 ). ( B ) На этой панели показан цикл B с уменьшением pH (, вставка 2 ), затем повышением pH (, вставка 1 ).На вставках представлены графики согласно уравнению. 2 для каждого направленного титрования рН. Таблица S3 содержит подходящие параметры, структурные совокупности (для многофазных кривых) и концентрации образцов. Таблица S4 содержит соответствующую статистическую информацию для каждой подгонки. ( ) указывает начальный pH для каждого цикла. Чтобы увидеть эту фигуру в цвете, зайдите в интернет.

Цикл A титрования dC 19 показывает трехфазные кривые развертывания для образцов, введенных в раствор с низким pH и оттитрованных до высокого pH (
A , вставка 1 ).Переходы принимают более характерное поведение, согласующееся с тем, что наблюдается для R17-отожженного (), а не для неотожженного R17. Следует отметить, что даже несмотря на то, что двухфазная регрессия части титрования с уменьшением рН в цикле А дала наилучшие результаты в соответствии с уравнением 2 (см. Таблицу S3), переход, вероятно, происходит в одной фазе. Это связано с тем, что якобиан для регрессии с использованием одной фазы был плохо обусловлен в результате передискретизации областей неизменных спектров CD ниже pH ∼5.5 и выше рН ∼6,5. Колебания шума прибора, когда спектр CD относительно постоянен в заданном диапазоне pH, могут привести к неправильной интерпретации значений наклона между точками данных процедурой регрессии как лежащих в основе структурных переходов. Титрование в убывающем направлении (
A , вставка 2 ) поэтому считается монофазным.

Для цикла B мы снова наблюдали почти идентичные кривые титрования сворачивания и разворачивания (
B ), оба из которых были монофазными.Выше и ниже переходов результаты подгонки согласно уравнению 2, не являются идеальными и являются результатом подобных несоответствий, отмеченных для титрования pH в цикле A в направлении уменьшения. Эти примеры иллюстрируют ограничения анализа с помощью уравнения. 2 для некоторых типов кривых титрования рН, преимущественно возникающих, когда свернутое и развернутое состояния разделены чрезвычайно узким диапазоном рН.

В целом поведение dC 19 заметно отличается от поведения R17. Это может быть результатом полной конформационной свободы, при которой ограничения на паттерны укладки, вызванные присутствием нуклеотидов, отличных от dC, приводят к более низкой общей стабильности наиболее быстро образующихся складок по сравнению с медленно формируемыми.Эффект хвостов, присутствующий в последовательности R17, но не для dC 19 , также может играть роль в наблюдаемых поведенческих несоответствиях, подобно тому, что было отмечено как возможность наблюдаемого гистерезиса при титровании hTeloC. Несмотря на это, разворачивание dC 19 в целом похоже на поведение R17, и поэтому мы предполагаем, что его характер подтверждает назначение конформации, аналогичной R17-4444, в качестве высокостабильной популяции при титровании R17 с повышением pH в цикле A.

Бромный след, анализ термического плавления и IDS

RAD17

показывают результаты бромного следа i-мотива R17 при pH 5 и pH 8. Три петли четко различимы при pH 5 по большей интенсивности dC полосы, которые соответствуют непарным нуклеотидам dC. При pH 8 бромирование происходит примерно одинаково для всех оснований dC, что указывает на случайное состояние клубка.

R17 бромный след. Гель, показанный слева, указывает на возможность существования двух конформаций внутримолекулярного i-мотива R17.Подготовка образцов для полосы pH 5 была аналогична образцам, введенным в раствор с низким pH и оттитрованным до высокого pH, и, следовательно, эти структуры представляют основные конформации R17 для трехфазного развертывания. Чтобы увидеть эту фигуру в цвете, зайдите в интернет.

Бромный след показывает две структурные возможности: R17-4444(3′E) и R17-4343 (5′E). Используя результаты этого анализа в сочетании с титрованием R17 с заменой dT, мы определяем R17-4444(3’E) как кратность высокой стабильности, отмеченную при титровании цикла A в направлении увеличения pH, и R17-4343(5’E) как складка с более низкой устойчивостью. Наша гипотеза состоит в том, что при быстрой индукции фолдинга внутримолекулярные продукты R17-4444(3’E) (~13%) распределяются в соотношении 1:3 к R17-4343(5’E) (~39%), тогда как оставшаяся популяция (~48%) состоит из димеров или межмолекулярных продуктов более высокого порядка (см. популяции в таблице S2). В ситуации медленной укладки мы определяем R17-4343 как доминирующую внутримолекулярную популяцию, а оставшуюся популяцию — как димеры или межмолекулярные продукты более высокого порядка. В центре внимания будущих исследований будет окончательное определение структур, дающих начало каждой популяции, с помощью множества других экспериментальных средств, не входящих в объем представленной здесь работы.

Термический анализ плавления (T M ) был также проведен для R17, введенного в буферы Бриттона-Робинсона с pH 5, 6 и 7 (рис. S23). Значения T M составляли 80,9, 63,2 и 46,8°C соответственно и не указывали окончательно на многофазное термически индуцированное разворачивание. Мы не проводили T M на любых мутантных последовательностях, потому что мы не можем гарантировать, что любой подготовленный образец будет состоять из 100% каждой конкретной конформации, что ставит под сомнение их достоверность.Действительно, кривые титрования рН для каждого мутанта показывают высокую вероятность того, что любой подготовленный образец будет иметь значительную популяцию альтернативных конформаций расположения ядра i-motif, которые могут исказить результаты T M . Кроме того, процессы изотермического складывания и разворачивания могут заметно отличаться от термоиндуцированного складывания и разворачивания. В дополнение к анализу T M , мы скомпилировали IDS для последовательностей R17, dC 19 , hTeloC и dT-замещенного R17, и все они подтверждают образование dC-dC + ( B на рис.С2–С22). Из-за сложности образцов конечное поведение IDS (17, 47) для образцов, популяции которых в свернутом состоянии могут содержать межмолекулярные структуры более высокого порядка, не было предсказательным.

Выводы

Мы показали, что сворачивание и разворачивание последовательностей, образующих i-мотив ДНК, hTeloC, dC 19 , R17 и dT-замещенных последовательностей R17 проявляют специфичное для последовательности поведение фолдинга и разворачивания, которое зависит от того, как свернутые последовательности состояние было получено. Последовательность теломер человека, hTeloC, демонстрировала постоянный гистерезис, для которого разворачивание всегда происходило при более высоком pH, чем складывание.Развертывание hTeloC после фолдинга, вызванного быстрым падением рН, было двухфазным и соответствовало образованию небольшой субпопуляции димеров. R17 демонстрировал необычное трехфазное развертывание после складывания, вызванного быстрым падением pH, при этом мы предполагаем, что субпопуляция R17-4444 (3’E) наблюдалась с переходным pH ~ 6,9 при физиологической температуре человека. Во время медленного фолдинга рН перехода R17 значительно снижался и, в отличие от hTeloC, не проявлял гистерезиса. Наконец, dC 19 , который по последовательности аналогичен R17, демонстрировал минимальный гистерезис независимо от того, как было получено свернутое состояние.

Кроме того, мы предоставили альтернативный метод математического анализа кривых pH-титрования, который позволяет легко выполнять деконволюцию и количественно определять многофазные структурные переходы i-мотивов по спектроскопическим данным. Мы применили наш метод титрования и анализа, чтобы охарактеризовать поведение изотермической укладки и разворачивания последовательности, образующей i-мотив, обнаруженной в промоторе гена репарации ДНК RAD17 .Эта последовательность имеет высокую вероятность образования складчатой ​​конформации, которая стабильна при нейтральном pH и физиологической температуре человека, что необычно для области i-мотивов в отсутствие агентов молекулярного краудинга, хотя недавно Dzatko et al. показали, что несколько последовательностей, образующих i-motif, складываются в живых клетках (48).

Want to say something? Post a comment

Ваш адрес email не будет опубликован.